抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112625126A(43)申请公布日2021.04.09(21)申请号202110029650.9C07K1/30(2006.01)(22)申请日2021.01.11C07K1/18(2006.01)C07K1/16(2006.01)(71)申请人重庆君同生物技术有限公司A61K39/40(2006.01)地址400010重庆市渝中区彭家花园13号A61P31/04(2006.01)附7号10-4#G01N33/569(2006.01)(72)发明人吕凤林潘玉竹曹政杨军陈彩宇(74)专利代理机构北京细软智谷知识产权代理有限责任公司11471代理人刘静荣(51)Int.Cl.C07K16/12(2006.01)C07K16/02(2006.01)C07K1/36(2006.01)C07K1/34(2006.01)权利要求书2页说明书7页附图1页(54)发明名称抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体及其制备方法和应用(57)摘要本发明属于生物制药领域，涉及一种抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体及其制备方法和应用。本发明的抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体为利用灭活蜂房哈夫尼菌为抗原免疫产蛋鸡，收集所述免疫蛋鸡的鸡蛋，并从免疫鸡蛋卵黄中分离和纯化得到。本发明的抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体对感染蜂房哈夫尼菌的中蜂具有显著的预防效果和治疗效果；抗体纯化后可制成药品，用于治疗蜜蜂因感染蜂房哈夫尼菌引起的相关疾病。CN112625126ACN112625126A权利要求书1/2页1.抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体为利用灭活蜂房哈夫尼菌为抗原免疫产蛋鸡，收集所述产蛋鸡的鸡蛋，并从免疫鸡蛋卵黄中分离和纯化得到。2.根据权利要求1所述的抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体由包括以下步骤的方法制备得到：(1)制备抗原：将蜂房哈夫尼菌灭活，作为抗原；(2)免疫蛋鸡：将灭活的蜂房哈夫尼菌与棒状纳米氢氧化铝按照质量比为1：0.5～1.5混合乳化后，首次免疫产蛋鸡，再进行第二次、第三次加强免疫，收集鸡蛋；其中，棒状纳米氢氧化铝为长径800～1000纳米、短径200～300纳米的棒状氢氧化铝；(3)分离纯化卵黄，得到卵黄抗体。3.根据权利要求2所述的抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体，其特征在于，步骤(1)中，将蜂房哈夫尼菌在营养肉汤中扩增培养至菌液浓度1～6×1010CFU/mL，热灭活后用生理盐水稀释至1～6×108CFU/mL，得到灭活蜂房哈夫尼菌抗原。4.根据权利要求2所述的抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体，其特征在于，步骤(3)中，在收集鸡蛋的卵黄液中加入9～10倍体积去离子水稀释，调节pH至5.0，于‑20℃冰箱中冷冻过夜；解冻后离心收集上清，过滤，收集滤液，得到卵黄抗体粗提物；对卵黄抗体粗提物进一步纯化，得到抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体。5.根据权利要求4所述的抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体，其特征在于，向卵黄抗体粗提物中加入饱和硫酸铵溶液至终浓度的45～75％，搅拌均匀后，4℃过夜，4℃条件下离心，加入PBS溶液重悬，再次加入饱和硫酸铵溶液至终浓度的45‑75％，搅拌均匀后，室温过夜，在室温下离心，用去离子水稀释沉淀至原体积，得到卵黄抗体提取液，将得到的卵黄抗体提取液用透析袋充分透析，得到抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体。6.权利要求1所述的抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)制备抗原：将蜂房哈夫尼菌灭活，作为抗原；(2)免疫蛋鸡：将灭活的蜂房哈夫尼菌与棒状纳米氢氧化铝按照质量比为1：0.5～1.5混合乳化后，首次免疫产蛋鸡，再进行第二次、第三次加强免疫，收集鸡蛋；其中，棒状纳米氢氧化铝为长径800～1000纳米、短径200～300纳米的棒状氢氧化铝；(3)分离纯化卵黄，得到卵黄抗体。7.根据权利要求6所述的抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，将蜂房哈夫尼菌在营养肉汤中扩增培养至菌液浓度1～6×1010CFU/mL，热灭活后用生理盐水稀释至1～6×108CFU/mL，得到灭活蜂房哈夫尼菌抗原。8.根据权利要求6所述的抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，在收集鸡蛋的卵黄液中加入9～10倍体积去离子水稀释，调节pH至5.0，于‑20℃冰箱中冷冻过夜；解冻后离心收集上清，过滤，收集滤液，得到卵黄抗体粗提物；对卵黄抗体粗提物进一步纯化，得到抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体。9.根据权利要求6所述的抗蜂房哈夫尼菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，向卵黄抗体粗提物中加入饱和硫酸铵溶液至终浓度的45～75％，搅拌均匀后，4℃过夜，4℃条件下离心，加入PBS溶液重悬，再次加入饱和硫酸铵溶液至终浓度的45‑75％，搅拌均匀后，室温过夜，在室温下离心，用去离子水稀释沉淀至原体积，得到卵黄抗体提取