点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114507669A(43)申请公布日2022.05.17(21)申请号202111179160.3A01N57/16(2006.01)(22)申请日2021.10.09A01P7/04(2006.01)C12N15/89(2006.01)(71)申请人宁波大学地址315211浙江省宁波市江北区风华路818号(72)发明人孙宗涛黄海剑魏中艳李俊敏张传溪陈剑平(74)专利代理机构北京市诚辉律师事务所11430专利代理师范盈(51)Int.Cl.C12N15/12(2006.01)C12N15/10(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N15/113(2010.01)权利要求书1页说明书6页序列表3页附图2页(54)发明名称点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP及其应用(57)摘要本发明提供点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白的应用，属于基因工程领域。根据本发明提供的RpSDP基因的dsRNA制剂，将其导入点蜂缘蝽体内，可有效地杀灭点蜂缘蝽，避免其为害农作物。本发明特异地针对点蜂缘蝽，对哺乳动物、鱼虾类、天敌昆虫和授粉昆虫无害，具有见效快、致死率高、环境友好等优势。CN114507669ACN114507669A权利要求书1/1页1.一种点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP基因,其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示或与SEQIDNO:1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的核苷酸或由其组成。2.一种点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP基因,其序列为SEQIDNO.1所编码的氨基酸或与SEQIDNO:1编码的氨基酸具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸或由其组成。3.一种RpSDP基因的克隆方法，步骤包括：(1)取点蜂缘蝽若虫，Trizol法提取总RNA，并利用点蜂缘蝽总RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)以点蜂缘蝽cDNA为模板，以序列如SEQIDNO.2所示的上游引物和序列如SEQIDNO.3所示的下游引物进行PCR扩增，得到含有的基因片段序列如SEQIDNO:4所示的PCR扩增产物；(3)将上述扩增获得的基因片段连接克隆载体，转化到大肠杆菌TG1，在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，获得含有目的基因的单克隆菌落；(4)将单克隆菌落在含有氨苄青霉素的LB液体培养内扩大培养，抽提含有目的基因的质粒；(5)以质粒为模板，以序列如SEQIDNO.5所示的上游引物和以序列如SEQIDNO.6所示的下游引物进行PCR扩增，获得大量的、单一的含有T7启动子的基因片段。4.一种RpSDP基因的dsRNA合成方法，具体步骤包括：(1)以权利要求3所述的PCR扩增获得的基因片段为DNA模板合成dsRNA，反应体系为：2μl10×ReactionBuffer，2μlATPsolution，2μlUTPsolution，2μlCTPsolution，2μlGTPsolution，2μlenzymemix，1μgDNA模板，并用无RNase水补齐到20μl，反应体系配好后混匀，37℃反应过夜；(2)向反应体系加入1μlTURBODNase，37℃反应15min；(3)将反应后的样品在65℃变性5min；(4)用Nanodrop测定dsRNA浓度，1％琼脂糖凝胶电泳确定dsRNA质量。5.一种特异性抑制RpSDP基因表达的dsRNA，其由权利要求4所述的方法合成获得。6.一种体外细胞，其含有权利要求5所述dsRNA。7.一种药物组合物，其包含权利要求5任一项所述dsRNA以及药学可接受的载体。8.权利要求5所述的dsRNA或权利要求7所述的药物组合物在制备杀虫剂中的用途。9.一种点蜂缘蝽防治方法，其特征是，将权利要求5所述dsRNA或者包含权利要求7所述的药物组合物喂食点蜂缘蝽。10.一种dsRpSDP导入点蜂缘蝽的方法，包括：(1)将合成的权利要求4所述的dsRpSDP装载入玻璃毛细管；(2)利用显微注射的方法将dsRpSDP导入点蜂缘蝽体内；(3)待点蜂缘蝽苏醒后，将其转移到种有大豆植株的笼子里。2CN114507669A说明书1/6页点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP及其应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程领域，涉及一种点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP的dsRNA合成、dsRNA导入点蜂缘蝽体内以及该基因在防治点蜂缘蝽相关病虫害中的应用。背景技术[0002]点蜂缘蝽(Riptortuspedestris)是大豆田间常见的刺吸式害虫，主要通过其刺吸式口器持续刺吸植株和种子汁液来获取养分。点蜂缘蝽的持续取食会导致大豆植株的发育不良甚至死亡，