点蜂缘蝽分泌蛋白RpSP4043及其在大豆“症青”防控中的应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927357A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202211211713.3C12N15/89(2006.01)(22)申请日2022.09.30A01N57/16(2006.01)A01P7/04(2006.01)(71)申请人宁波大学地址315211浙江省宁波市江北区风华路818号(72)发明人孙宗涛胡彪魏中艳张合红李雁军陈剑平(74)专利代理机构北京市诚辉律师事务所11430专利代理师范盈(51)Int.Cl.C12N15/12(2006.01)C07K14/435(2006.01)C12N15/10(2006.01)C12N15/113(2010.01)权利要求书1页说明书6页序列表（电子公布）附图1页(54)发明名称点蜂缘蝽分泌蛋白RpSP4043及其在大豆“症青”防控中的应用(57)摘要本发明涉及一种点蜂缘蝽分泌蛋白基因RpSP4043的dsRNA合成以及该基因在大豆“症青”病害防控中的应用。CN115927357ACN115927357A权利要求书1/1页1.一种点蜂缘蝽分泌蛋白RpSP4043基因,其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示或与SEQIDNO.1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的核苷酸或由其组成。2.一种点蜂缘蝽分泌蛋白RpSP4043基因，其序列为SEQIDNO.8所示的氨基酸或与SEQIDNO.8所示的氨基酸具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸或由其组成。3.一种RpSP4043基因的克隆方法，步骤包括：(1)取点蜂缘蝽成虫唾液腺，Trizol法提取总RNA，反转录获得cDNA第一条链；(2)以步骤(1)中获得的点蜂缘蝽cDNA为模板，以序列SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的上下游引物进行PCR扩增；(3)将上述扩增获得的基因片段连接克隆载体pBinGFP，转化到大肠杆菌DH5α，在含有卡那霉素的LB固体培养基上培养，获得含有基因片段的单克隆菌落；(4)挑取单克隆菌落在含有卡纳霉素的LB液体培养基中扩大培养，抽提质粒，进行DNA测序，得到含有如SEQIDNO.1所示序列的Bin‑RpSP4043；(5)以Bin‑RpSP4043质粒为模板，利用SEQIDNO.6所示的上游引物SEQIDNO.7所示的下游引物进行PCR扩增，获得含有T7启动子的RpSP4043基因片段。4.一种RpSP4043基因的dsRNA合成方法，具体步骤包括：(1)以权利要求3所述PCR扩增获得的基因片段为模板合成dsRNA，反应体系为：10×ReactionBuffer2μl，ATPsolution2μl，UTPsolution2μl，CTPsolution2μl，GTPsolution2μl，T7RNAPolymerase2μl，DNA模板1μg，RNase‑freeH2O补齐至20μl，混匀，37℃反应8h；(2)向体系中加入1μlDNase，37℃反应15min；(3)取反应后的样品65℃变性5min，测定dsRNA浓度，并通过1％琼脂糖凝胶电泳确定RNA质量；(4)将剩余dsRpSP4043储存于‑80℃备用。5.一种特异性抑制RpSP4043基因表达的dsRNA，其由权利要求4所述的方法合成获得。6.一种体外细胞，其含有权利要求5所述dsRNA。7.一种药物组合物，其包含权利要求5‑6任一项所述dsRNA以及药学可接受的载体，所述载体为纳米材料载体。8.权利要求5所述的dsRNA或权利要求7所述的药物组合物在制备杀虫剂中的用途。9.一种点蜂缘蝽防治方法，其特征是，将权利要求5所述dsRNA或者包含权利要求7所述的药物组合物喷洒植株。10.一种减轻或防治大豆“症青”的方法，其特征是，将权利要求5所述dsRNA或者包含权利要求7所述的药物组合物喷洒大豆植株。2CN115927357A说明书1/6页点蜂缘蝽分泌蛋白RpSP4043及其在大豆“症青”防控中的应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程领域，涉及一种点蜂缘蝽分泌蛋白RpSP4043的dsRNA合成、dsRNA导入点蜂缘蝽体内以及该基因在防治大豆“症青”相关病害中的应用。背景技术[0002]近年来，大豆“症青”在我国各大豆产区呈爆发式出现，在黄淮海地区尤为严重。大豆“症青”具体表现为品种生育期结束，应进入成熟期时，植株茎、叶及豆荚仍滞绿不衰老，荚而不实或籽粒发育不良，形成瘪粒畸形等。[0003]点蜂缘蝽(Riptortuspedestris)是大豆田间常见的刺吸式害虫，主要通过其刺吸式口器持续刺吸植株和种子汁液来获取养分。点蜂缘蝽的持续取食会导致大豆植