罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN101890159A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN101890159A(43)申请公布日2010.11.24(21)申请号201010207289.6C12R1/46(2006.01)(22)申请日2010.06.23(83)生物保藏信息CCTCCNO:M2092792009.11.23CCTCCNO:M2092782009.11.23(71)申请人广西壮族自治区水产研究所地址530021广西壮族自治区南宁市青山路8号(72)发明人陈明梁万文甘西王瑞雷爱莹李莉萍李超陈晓汉余晓丽徐增辉(74)专利代理机构广西南宁明智专利商标代理有限责任公司45106代理人黎明天(51)Int.Cl.A61K39/09(2006.01)C12N1/20(2006.01)A61P31/04(2006.01)权利要求书1页说明书3页(54)发明名称罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法(57)摘要本发明公开了一种罗非鱼二联链球菌灭活疫苗及其制备方法，该疫苗是将从发病罗非鱼体内分离出的海豚链球菌和无乳链球菌分离纯化、液体活化培养、生物反应器的扩大培养、培养物的灭活和洗涤，以及将灭活完全的菌体按等比例混合制成罗非鱼二联链球菌灭活疫苗。通过使用可调连续注射器对罗非鱼进行胸腔或腹腔免疫，能有效防治罗非鱼链球菌病的发生，可应用于罗非鱼养殖中。CN10895ACN101890159A权利要求书1/1页1.一种罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于：将从发病罗非鱼体内分离出的链球菌菌株分离纯化、液体活化培养、生物反应器的扩大培养、培养物的灭活和洗涤，以及将灭活完全的菌体按等比例混合制成罗非鱼二联链球菌灭活疫苗。2.根据权利要求1所述的罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述链球菌菌种包括：海豚链球菌和无乳链球菌。3.根据权利要求1所述的罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：(1)将从病鱼体内分离的海豚链球菌和无乳链球菌分别接种到胰蛋白胨大豆琼脂培养基，28±0.5℃培养24小时；(2)分别将步骤(1)固体培养基上培养好的菌体，接种到已经高压灭菌并盛有1000ml的胰蛋白胨大豆液体培养基的锥形瓶中，在振荡摇床中进行小体积的液体活化培养，培养温度28±0.5℃，摇床转速120-150转/分，培养时间为20-24小时；(3)按2％或3％的比例将步骤(2)中培养好的菌体接种到生物反应器中已经高压灭菌的胰蛋白胨大豆液体培养基中，培养温度28±0.5℃，培养时间24-48小时，当链球菌生长到108或109CFU/ml，停止反应；(4)取出步骤(3)培养的菌液，加入0.1～0.5％福尔马林溶液，灭活24-48小时；(5)0.22μm滤膜超滤后用磷酸盐缓冲溶液将所得菌体稀释成浓度为5.0×107-5.0×108CFU/ml；(6)根据罗非鱼的发病规律及程度，将以上两种灭活菌以等比例混合制成罗非鱼二联链球菌灭活疫苗。2CN101890159A说明书1/3页罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种罗非鱼疾病的预防用疫苗，具体说涉及罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法。背景技术[0002]罗非鱼原产热带、亚热带，属暖水性鱼类，具有繁殖力强、生长速度快、粗食、抗病力强等优点，是当前水产养殖业的重要养殖品种之一。随着全球性海洋捕捞渔业资源的衰退，国际市场对水产养殖产品的需求越来越大。我国罗非鱼养殖业发展迅速，产量以平均每年14.75％左右的速度递增，稳居世界首位。据中国水产流通与加工协会罗非鱼分会提供的数据，2008年我国罗非鱼产量120万吨，约占全球罗非鱼总产量的55％，其中出口量22.44万吨，是我国水产品出口创汇主要品种之一。[0003]近年来随着片面地重视规模化发展和高产，造成罗非鱼养殖病害频频暴发，养殖发病率高达75％。其中最主要的病害为链球菌病，并且有逐年递增的趋势。按2008年我国罗非鱼产量计算，估计链球菌病给我国罗非鱼产业造成的直接经济损失就高达15-30亿元。病害的暴发与随之带来的产品安全问题已成为制约我国罗非鱼产业继续向前发展的瓶颈。然而，目前缺乏一套行之有效的方案预防和治疗该病，药物只能在早期起到控制病情的辅助性作用，但随着耐药和抗药性的产生和积累，该病的现状几乎是“无药可治可防”。疫苗免疫是预防和控制罗非鱼链球菌病最具前景、安全和环保的方法之一，必需及早研制。研究发现，罗非鱼链球菌病的流行菌种主要为S.iniae链球菌和S.agalactiae链球菌。发明内容[0004]本发明的目的是为了控制罗非鱼链球菌病的传播与爆发，提供一种罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法，该方法利用分离到的高免疫原性强毒力链球菌菌株，通过培养基和培养条件的优化培养提高主要保