解淀粉芽孢杆菌D4及用该菌发酵生产凝乳酶的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102041237A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102041237A(43)申请公布日2011.05.04(21)申请号201010005309.1(22)申请日2010.01.15(83)生物保藏信息CGMCC32902009.09.23(71)申请人甘肃农业大学地址730070甘肃省兰州市安宁区营门村1号(72)发明人甘伯中张卫兵宋曦高维东贺晓玲(74)专利代理机构甘肃省知识产权事务中心62100代理人张克勤(51)Int.Cl.C12N1/20(2006.01)C12N9/54(2006.01)C12R1/07(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图2页(54)发明名称解淀粉芽孢杆菌D4及用该菌发酵生产凝乳酶的方法(57)摘要本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌D4及用该菌发酵生产凝乳酶的方法，本发明菌种是采用酪蛋白培养基从甘肃省甘南藏族自治州牦牛放牧环境土壤中筛选而得，经摇瓶液体深层发酵可得凝乳酶，酶活可达2310.2SU/ml。该凝乳酶可用于干酪和干酪素生产。CN102437ACCNN110204123702041240A权利要求书1/1页1.一种解淀粉芽孢杆菌D4(CGMCC3290)，具有产凝乳酶的能力。2.一种用解淀粉芽孢杆菌发酵生产凝乳酶的方法，其特征在于：在培养基中培养解淀粉芽孢杆菌D4(CGMCC3290)，经种子培养和液体深层发酵制得凝乳酶。3.根据权利要求2的方法，其特征在于：种子培养基成分为，牛肉膏3g/L，蛋白胨10～12g/L，氯化钠5g/L，pH值7.0；培养条件：培养时间为13小时，温度37℃，摇床转速200～240r/min；液体深层发酵培养基组成以质量百分比计：麸皮浸出液为10～18％、葡萄糖3～8％、脱脂乳2％、磷酸氢二钠0.2％、干酪素0.1％、硫酸镁0.10％、余量为蒸馏水；发酵条件：接种量为3％，发酵时间48小时，温度37℃，摇床转速为170～180r/min；所用麸皮浸出液制备方法为：将10～18g麸皮加入到100ml水中，煮沸10min，过滤后用蒸馏水补足100ml，得到10～18％麸皮浸出液。2CCNN110204123702041240A说明书1/6页解淀粉芽孢杆菌D4及用该菌发酵生产凝乳酶的方法技术领域[0001]本发明属于生物工程技术领域，涉及解淀粉芽孢杆菌D4菌株及用它制备凝乳酶的方法。背景技术[0002]凝乳酶是干酪制作过程中一种关键性酶，其主要作用是专一性的剪切酪蛋白Phe105-Met106的肽键，形成稳定的副κ-酪蛋白及亲水性的糖巨肽；当总κ-酪蛋白被水解掉约85％时，在Ca2+存在下通过在酪蛋白胶粒间形成的化学键形成凝块或凝固的乳，从而酪蛋白胶粒发生沉淀。为了满足我国干酪和干酪素生产快速发展的要求，解决凝乳酶的供应矛盾，对凝乳酶的研究与开发已成为乳品业的当务之急。国家发展改革委员会科技部把凝乳酶的研制列为国家863计划优先发展的项目和国家“七五”、“八五”、“九五”重点攻关项目。凝乳酶主要有三种来源，分别为动物凝乳酶，植物凝乳酶和微生物凝乳酶。[0003]动物凝乳酶中使用最广泛的是小牛皱胃酶。采用小牛皱胃酶生产干酪时具有较好的凝乳效果，所产干酪具有出品率较高，不产生苦味等优点。据统计全世界每年要宰杀5000万头小牛，以获得凝乳酶。随着干酪工业的发展，凝乳酶需求不断增加，小牛皱胃酶供不应求导致价格不断上涨。植物凝乳酶(蛋白酶)分布于木瓜、无花果、波萝、南瓜和生姜等植物的果实、叶、茎和根等部位。大多数植物蛋白酶在干酪生产过程中的蛋白质水解力过强，易干酪产生苦味，而且成品得率较低，质地也稍软。[0004]由于微生物具有生长周期短，生长速度快，生长条件易于控制，生产成本低等优点，自1964年Arima首次发现微小毛霉(Mucormicrous)可以产凝乳性的蛋白酶以来，微生物凝乳酶成为凝乳酶研究的重点。到目前为止，研究发现的产凝乳酶的微生物有放线菌中的链霉菌属(Streptomyces)、小单胞菌属(Micromonospora)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)；真菌中的根霉(Rhizopus)、总状毛霉(Mucorracemosu)、易脆毛霉(Mucorfuagilis)、米黑毛霉(Mucornichei)、寄生内座壳菌(Endothiaparasitisa)、粟疫菌(Endothiaparasitica)；细菌中的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto)。目前工业生产上多用米黑毛霉和黑曲霉等真菌发酵生产凝乳酶，存在菌种培养时间长、菌丝易受破坏、发酵周期长、生产工艺复杂和发酵产物不易提取等缺点。[0005]本发明所涉及的一株解