抗病原菌的牛源解淀粉芽孢杆菌的制备方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115948282A(43)申请公布日2023.04.11(21)申请号202211473547.4A61P31/04(2006.01)(22)申请日2022.11.22C12R1/07(2006.01)(71)申请人石河子大学地址832000新疆维吾尔自治区石河子市北四路221号石河子大学(72)发明人胡圣伟倪伟王婷李村院李晓悦(74)专利代理机构乌鲁木齐恒智专利商标代理事务所(普通合伙)65102专利代理师李靖(51)Int.Cl.C12N1/20(2006.01)C12N1/02(2006.01)A23K10/18(2016.01)A61K35/742(2015.01)权利要求书1页说明书7页序列表（电子公布）附图3页(54)发明名称抗病原菌的牛源解淀粉芽孢杆菌的制备方法(57)摘要本发明公开了一种抗病原菌的牛源解淀粉芽孢杆菌的制备方法，该方法的具体步骤为：(1)牛源肠道微生物中芽孢杆菌的分离纯化；(2)分离纯化芽孢杆菌16SrRNA基因扩增测序；(3)分离菌株的分子学鉴定：将测序结果在NCBI中的BLAST软件进行GeneBank同源性比较，构建种属系统发育树；(4)致病菌抑制能力及抗生素敏感度测定；(5)益生特性的评价：对鉴定得到的菌株进行耐酸耐胆盐、耐人工肠胃液、自聚集率实验中菌株的存活率进行测定；(6)产水解酶测定：纤维素酶和淀粉酶。本发明通过从健康牛新鲜粪便样品中分离纯化出解淀粉芽孢杆菌的细菌，所得到的菌株在体外抑菌能力和抗生素抗菌性具有突出的优点。CN115948282ACN115948282A权利要求书1/1页1.一种抗病原菌的牛源解淀粉芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：A、样品采集：采集牛新鲜粪便，无菌试管密封包装4℃低温运至实验室；B、样品预处理：将A步骤得到的新鲜牛粪便使用5g±1g置于无菌的50mL离心管中，置于20℃保存；C、菌株的分离与纯化：对B步骤预处理后的样品，取1mL稀释液于装有9mL无菌生理盐水的试管中进行稀释，10‑2～10‑8各1mL于溴甲酚绿固体筛选培养基中，进行稀释涂布培养，待凝固后置于37℃培养箱恒温培养48～72h；挑取溴甲酚绿固体筛选培养基中菌落边缘变黄的菌落于液体培养中进行培养；反复进行分离纯化2～3次后，挑取在筛选养基中有生长特征的菌落进行分离纯化，得到目标菌种。2.根据权利要求1所述的一种抗病原菌的牛源解淀粉芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：所述溴甲酚绿固体筛选培养基(1000mL)由牛肉膏5g，蛋白胨5g，葡萄糖20g，NaCI5g，溴甲酚绿0.1g，琼脂20g和余量的蒸馏水组成，调节pH6.8‑7.2，于121℃高温高压灭菌20min得到。3.根据权利要求1所述的一种抗病原菌的牛源解淀粉芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：C步骤得到的目标菌种和50％甘油以1:1混匀后置于‑20℃保存或‑80℃长期保存，保存后的菌种可以用于后续验证试验。2CN115948282A说明书1/7页抗病原菌的牛源解淀粉芽孢杆菌的制备方法技术领域[0001]本发明涉及微生物技术领域和益生菌制剂领域，具体涉及抗病原菌的牛源益生解淀粉芽孢杆菌及其制备。背景技术[0002]自1950年代以来，抗生素已被用于畜牧业领域，用于促进生长、治疗和预防疾病。制药工业生产的抗生素高达80％用于食品生产，大多数抗生素被用作饲料添加剂促进动物的生长(LowCX,TanLT,AbMutalibNS,PusparajahP,GohBH,ChanKG,LetchumananV,LeeLH.UnveilingtheImpactofAntibioticsandAlternativeMethodsforAnimalHusbandry：AReview.Antibiotics(Basel).2021May13；10(5)：578.)。然而，研究表明，滥用抗生素导致出现了威胁动物健康和人类健康的多重耐药病原体，耐药菌株对于抗生素不敏感，可在动物机体内大量繁殖，造成动物体内菌群失调问题以及抗生素本身的残留性问题越来越严重，影响正常机体健康(HAFIZIFTIKHARHUSSAIN.FunctionalGenomicandTranscriptomicProfilingofPathogenicMultidrugResistantandHighlyVirulentEscherichiaColiofPoultryOrigin[D].华中农业大学,2017.)；因此需要寻找一种可用于临床及生产的抗生素的代替品，近年来，微生物作为饲料添加剂应用于畜牧业也得到了认可，国内外研制也出了多种益生菌活菌制剂，益生菌活菌制剂来替代抗生素作为一种新的饲料添加剂必将成为一种新趋势(Che