一种针对微量样本的转录组高通量测序方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103667442103667442A(43)申请公布日2014.03.26(21)申请号201310419151.6(22)申请日2013.09.13(71)申请人西南民族大学地址610041四川省成都市武侯区一环路南四段16号(72)发明人兰道亮李键熊显荣陈亚冰胡敏苏小珊钟珍龚蔚华(74)专利代理机构成都信博专利代理有限责任公司51200代理人张澎(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)权权利要求书2页利要求书2页说明书6页说明书6页附图2页附图2页(54)发明名称一种针对微量样本的转录组高通量测序方法(57)摘要本发明公开了一种针对微量样本的转录组高通量测序方法，包括以下步骤：微量样本总RNA提取；针对真核生物样本取样；微量RNA的扩增富集：采用SMART技术对微量RNA进行的相关富集对提取的微量总RNA进行反转录及相应的扩增富集；构建cDNAIllumina-solexa测序文库；在富集生成的cDNA层面上进行片段化后使用IlluminaHiSeqTM2000进行高通量测序。本发明方法所需最低起始的样本核酸量可低至10ng，避免了传统转录组高通量测序所需大量样本核酸起始量的要求，能有效应用于微量样本的转录组高通量测序，尤其对无法获得大样本量的稀有样本及特殊样本具有很高的应用前景。CN103667442ACN1036742ACN103667442A权利要求书1/2页1.一种针对微量样本的转录组高通量测序方法,其特征在于，包括以下步骤：a.微量样本总RNA提取;针对真核生物样本取样;b.微量RNA的扩增富集：采用SMART技术对微量RNA进行的相关富集对提取的微量总RNA进行反转录及相应的扩增富集;c.构建cDNAIllumina-solexa测序文库:在富集生成的cDNA层面上进行片段化后使用IlluminaHiSeqTM2000进行高通量测序。2.如权利要求1所述之针对微量样本的转录组高通量测序方法，其特征在于，步骤c采用如下的步骤：（1）cDNA片段化：利用CovarisE210仪器对经SMART技术扩增富集的cDNA进行片段化，片段长度设置为200bp，然后琼脂糖凝胶电泳检测验证；（2）cDNA双链末端修复:利用T4DNApolymerase、KlenowDNApolymerase和T4PNK，将合成的cDNA的末端补平并进行磷酸化修饰；（3）cDNA3’末端腺苷酸化：利用Klenowexo-polymerase对经过cDNA进行3＇末端腺苷酸化，使其3＇末端带有一个突出的腺苷酸“A”，以便于随后的接头连接；（4）测序接头连接：利用T4DNALigase将IlluminaPEadapter接头连接到经腺苷酸化的cDNA片段的3＇末端；（5）琼脂糖电泳分离及片段回收：通过2%的琼脂糖凝胶电泳分离加有接头的cDNA片段，回收凝胶中大小为200bp±25bp的cDNA片段；（6）cDNA片段扩增构建测序文库：利用引物PCRPrimerPE1.0和PCRPrimerPE2.0，以上述回收的大小为200bp±25bp的cDNA片段为模板，进行15个循环的PCR扩增以富集加有接头的大小为200bp±25bp的cDNA片段；利用QIAquickPCRPurificationKit对扩增产物进行纯化，经AgilentTechnologies2100Bioanalyzer检测合格后，作为测序的cDNA文库；（7）使用IlluminaHiSeqTM2000进行高通量测序。3.如权利要求1所述之针对微量样本的转录组高通量测序方法，其特征在于，步骤a中提取总RNA的试剂盒选用市售RNeasyMicroKit试剂盒。4.如权利要求1所述之针对微量样本的转录组高通量测序方法，其特征在于，步骤b中采用SMART技术对提取的微量RNA进行了相关的扩增富集，以达到进一步测序建库的要求,具体实施步骤如下：（1）第一链cDNA的合成：提取不低于10pg的总RNA与1.5μlSMARTII寡核苷酸（12μM）和1.5μlcDNASynthesis引物（12μM）混合，并用ddH2O补足体系至10μl;在热循环仪上70℃孵育2min，然后在室温下加入5×第一链反应缓冲液（250mMTris-HCl,Ph8.3；375mmol/LKCl；30mmol/LMgCl2）4μl，dNTP（10mM）1μl，RNaseInhibiter（40U/μl）0.5μl，PrimeScript反转录酶（200U/μl）1μl，并用ddH2O补足总体系至20μl。42℃孵育60min，然后加2μl0.5mol/LEDTA终止反应;（2）长距离PCR（LD-PCR