一种难溶性脂肽的纯化制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108707182A(43)申请公布日2018.10.26(21)申请号201810561853.0(22)申请日2018.06.04(71)申请人江苏吉泰肽业科技有限公司地址江苏省盐城市滨海县滨海医药产业园新安大道799-2号(72)发明人秦敬国任丽萍徐海红徐红岩(74)专利代理机构上海浦东良风专利代理有限责任公司31113代理人张劲风(51)Int.Cl.C07K1/36(2006.01)C07K1/34(2006.01)C07K1/20(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图1页(54)发明名称一种难溶性脂肽的纯化制备方法(57)摘要本发明提供了一种难溶性脂肽的纯化方法，主要解决目前的纯化方法中粗产品难溶，收率低的问题。本发明技术方案是：先用氨水溶液加热溶解样品，提高脂肽的溶解性。然后以高效液相色谱法纯化，采用聚合物色谱柱以碱性溶剂为流动相，有效提高了产品的收率。以C4色谱柱做二次纯化并同时转盐，减少了一步纯化过程。并有效降低有机溶剂的使用量，缩短时间，达到成本低，收率高的目的，同时适用于工业化放大生产。CN108707182ACN108707182A权利要求书1/1页1.一种难溶性脂肽的纯化方法，其特征在于：包括下述步骤：（1）将脂肽粗品溶于氨水中，放于水浴锅中加热搅拌直至溶液呈澄清状态，冷却，用滤膜过滤，收集滤液；（2）用反相高效液相色谱法进行纯化，填料为反相聚合物色谱柱，流动相A为质量百分比为0.05%~0.1%的碳酸氢铵水溶液，流动相B为纯乙腈溶液，梯度洗脱，流动相梯度为A:B由（60~40）:（40~60）到（40~20）:（60~80），收集主峰；（3）用反相高效液相色谱法进行二次纯化同时转盐，填料为C4反相硅胶柱，流动相C为体积百分比为1~5%的冰醋酸水溶液，流动相D为体积百分比为1~5%的冰醋酸乙腈溶液，梯度洗脱，流动相梯度为C:D由（50~40）:（50~60）到（30~20）:（70~80），收集检测合格后的主峰，减压蒸馏，冷冻干燥，得到纯度大于98%以上的脂肽。2.根据权利要求1所述的一种难溶性脂肽的纯化方法，其特征在于：所述步骤（1）中，水浴锅加热温度为35~45℃，氨水溶液的浓度为质量百分比10%，脂肽粗品的溶解浓度为20mg/ml~40mg/ml。3.根据权利要求2所述的一种难溶性脂肽的纯化方法，其特征在于：水浴锅加热温度为40℃，脂肽粗品的溶解浓度为30mg/ml。4.根据权利要求1所述的一种难溶性脂肽的纯化方法，其特征在于：所述步骤（2）中，填料为PS/DVB基质的反相聚合物填料，粒径为10-15μm。5.根据权利要求4所述的一种难溶性脂肽的纯化方法，其特征在于：填料粒径为10μm。6.根据权利要求1所述的一种难溶性脂肽的纯化方法，其特征在于：所述步骤（2）中，流动相A为质量百分比为0.1%的碳酸氢铵水溶液。7.根据权利要求1所述的一种难溶性脂肽的纯化方法，其特征在于：所述步骤（2）中，流动相梯度为A:B为60:40到40:60。8.根据权利要求1所述的一种难溶性脂肽的纯化方法，其特征在于：所述步骤（3）中，填料为四烷基硅烷键合硅胶的反相填料，粒径为10-15μm。9.根据权利要求8所述的一种难溶性脂肽的纯化方法，其特征在于：所述粒径为10μm。10.根据权利要求1所述的一种难溶性脂肽的纯化方法，其特征在于：所述步骤（3）中，流动相C为体积百分比为2%的冰醋酸水溶液，流动相D为体积百分比为2%的冰醋酸乙腈溶液，流动相梯度为C:D为45:55到35:65。2CN108707182A说明书1/4页一种难溶性脂肽的纯化制备方法技术领域[0001]本发明属于多肽纯化领域，具体涉及一种脂肽的纯化方法。技术背景[0002]美容肽或美容胜肽,是属于降解的小分子胶原蛋白，含氨基酸基团，一般由2-10个氨基酸组成。胜肽也是人体中原本就存在的成分，是一种由氨基酸组成的链状结构。我们所熟悉的蛋白质，就是一种多胜肽链。胜肽的生物学活性取决于其氨基酸组成和序列，人体内各种生理进程几乎都是由特定的氨基酸序列组成的多肽或者蛋白质调控的。因此，生物活性肽成为了化妆品研发和应用的全新方向和思路，并且功能越来越细分，如：抗衰老、抗过敏、修复、抗氧化、抗水肿、促进毛发再生、抑制黑色素生成、丰胸、减肥等。[0003]脂肽（棕榈酰六肽）即为美容肽的一种，是一种属于Matrikine系列的信号肽，特别与修复年龄相关性皮肤损伤有关。在弹力蛋白的整个分子结构中六肽VGVAPG片段重复了六次之多，因此被称作“springfragment”。棕榈酰六肽具有趋化作用，可以促进真皮成纤维细胞迁移、增殖和基质大分子合成（如弹力蛋白，胶原蛋白等）,为皮肤提供支撑。同