一种大规模纯化质粒DNA的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109456963A(43)申请公布日2019.03.12(21)申请号201811600919.9(22)申请日2018.12.26(71)申请人广州白云山拜迪生物医药有限公司地址510070广东省广州市番禺区万宝北街1号(72)发明人符美娟丘力功邱壮伟李润明倪世明(74)专利代理机构广州三环专利商标代理有限公司44202代理人颜希文宋静娜(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书7页附图1页(54)发明名称一种大规模纯化质粒DNA的方法(57)摘要本发明涉及一种大规模纯化质粒DNA的方法，属于DNA疫苗、核酸疫苗、基因治疗等生物工程技术领域。本发明通过对碱裂解液加入硅藻土助滤澄清来获得简便、快速的分离效果，再经过澄清裂解液的浓缩超滤、分子筛层析、亲和层析、阴离子交换层析、终产品的置换浓缩、除菌过滤等纯化步骤，可生产出符合药用标准的质粒DNA产品。本发明首次使用硅藻土助滤并应用于质粒DNA产品的纯化领域中，操作方法简便易放大；本发明提供的质粒DNA纯化方法操作性强、重复性好、纯化的质粒DNA总回收率高并符合药用标准，可满足工业化大生产要求。CN109456963ACN109456963A权利要求书1/2页1.一种大规模纯化质粒DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在含有3～30Kb质粒DNA的细菌碱裂解液中，加入硅藻土温和混匀，得混合液；(2)将步骤(1)获得的混合液进行澄清处理，然后使用缓冲液冲洗硅藻土进行回收，得澄清的裂解液；(3)将步骤(2)获得澄清的裂解液通过超滤装置进行浓缩，并使用洗滤液进行超滤，得浓缩裂解液；(4)将步骤(3)获得的浓缩裂解液，过分子筛层析柱，收集含目的质粒DNA的洗脱峰；(5)将步骤(4)获得的洗脱峰，调节硫酸铵浓度至2M后，过亲和层析柱，洗脱得到含有目的质粒DNA的洗脱峰；(6)将步骤(5)获得的洗脱峰，用两倍体积注射用水稀释后，过阴离子交换层析柱，洗脱得到含有目的质粒DNA的洗脱峰；(7)将步骤(6)获得的洗脱峰，通过超滤装置进行浓缩，并置换于缓冲液中；(8)将步骤(7)获得的浓缩后的质粒DNA进行除菌过滤，并定容使质粒DNA浓度及缓冲液符合药用标准。2.如权利要求1所述的大规模纯化质粒DNA的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，硅藻土的用量为每升碱裂解液中加入50～130g硅藻土。3.如权利要求1所述的大规模纯化质粒DNA的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，澄清处理为采用孔径2～20μm的过滤装置进行澄清过滤，过滤装置包括滤膜、滤板和深层过滤器。4.如权利要求1所述的大规模纯化质粒DNA的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，缓冲液中氯化钠浓度为50～150mM，乙二胺四乙酸浓度为10～100mM，三羟甲基氨基甲烷浓度为10～100mM，PH值为7.0～8.0。5.如权利要求1所述的大规模纯化质粒DNA的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，超滤装置为中空纤维柱式超滤装置、膜包式超滤装置中的至少一种，超滤装置中超滤膜的截留分子量为50～750KD；所述洗滤液为50～200mMNaCl洗滤液。6.如权利要求1所述的大规模纯化质粒DNA的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，分子筛层析柱为Sepharose4FastFlow分子筛层析柱、Sepharose6FastFlow分子筛层析柱中的至少一种；平衡分子筛层析柱缓冲液中乙二胺四乙酸浓度为10～100mM，三羟甲基氨基甲烷浓度为10～100mM，PH值为7.0～8.0。7.如权利要求1所述的大规模纯化质粒DNA的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，亲和层析柱为PlasmidSelectXtra亲和层析柱，平衡亲和层析柱缓冲液中硫酸铵浓度为2M/L，乙二胺四乙酸浓度为10～100mM，三羟甲基氨基甲烷浓度为10～100mM，PH值为7.0～8.0；用于洗脱目的质粒DNA的缓冲液中硫酸铵浓度为1.7M/L，氯化钠浓度为0.3M/L，乙二胺四乙酸浓度为10～100mM，三羟甲基氨基甲烷浓度为10～100mM，PH值为7.0～8.0。8.如权利要求1所述的大规模纯化质粒DNA的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，阴离子交换层析柱为SOURCE30Q阴离子交换层析柱，平衡阴离子交换层析柱缓冲液中氯化钠浓度为0.4M/L，乙二胺四乙酸浓度为10～100mM，三羟甲基氨基甲烷浓度为10～100mM，PH值为7.0～8.0；用于洗脱目的质粒DNA的缓冲液中氯化钠浓度为0.6～1.0M/L，乙二胺四乙酸浓度为10～100mM，三羟甲基氨基甲烷浓度为10～100mM，PH值为7.0～8.0。2CN1094569