一种用于检测人类血液中LBP含量的试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109507127A(43)申请公布日2019.03.22(21)申请号201811497826.8(22)申请日2018.12.07(71)申请人上海浩港生物技术有限公司地址200120上海市浦东新区芙蓉花路500弄2号楼1-2层(72)发明人董学渊蒋林彬(74)专利代理机构北京华智则铭知识产权代理有限公司11573代理人陈向敏(51)Int.Cl.G01N21/31(2006.01)G01N33/68(2006.01)权利要求书2页说明书5页附图1页(54)发明名称一种用于检测人类血液中LBP含量的试剂盒(57)摘要本发明属于试剂盒技术领域，公开了一种用于检测人类血液中LBP含量的试剂盒，所述用于检测人类血液中LBP含量的试剂盒包括：稳定剂、防腐剂、悬浮稳定剂、缓冲液、EDTA、增凝剂、保护剂、交联LBP抗体的聚苯乙烯胶乳微球。本发明提供的缓冲液甘氨酸的制备方法，具备高效、节能、无三废，节约原材料，提高产品质量等优势，提高酸碱缓冲效果；同时，提供β-葡聚糖制备纯化方法，不仅不会破坏β-葡聚糖的分子结构和化学品质，还可有效提升β-葡聚糖的纯度和收率，提高试剂盒的检测结果。CN109507127ACN109507127A权利要求书1/2页1.一种用于检测人类血液中LBP含量的试剂盒，其特征在于，所述用于检测人类血液中LBP含量的试剂盒包括：稳定剂、防腐剂、悬浮稳定剂、缓冲液、EDTA、增凝剂、保护剂、交联LBP抗体的聚苯乙烯胶乳微球；稳定剂选自KCl、NaCl、CaCl2、Na2CO3、Na2SO4或者K2SO4一种或多种组合；防腐剂为叠氮钠、硫柳汞或者ProClin300；悬浮稳定剂为PEG8000、蔗糖、甘油或者葡萄糖；缓冲液包括：苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为4－7.5g/L，生物缓冲液1的pH值为7.4－7.6；EDTA的浓度为20～100mmol/L；增凝剂为PEG8000或者β-葡聚糖；聚苯乙烯乳胶微球的表面官能团为氨基、羧基、酰肼、醛基或环氧基，聚苯乙烯乳胶微球的的粒径在200～600nm。2.如权利要求1所述用于检测人类血液中LBP含量的试剂盒，其特征在于，所述用于检测人类血液中LBP含量的试剂盒检测方法如下：步骤一，试剂准备；(1)试剂A的制备：配置缓冲液：甘氨酸1.9g/L、水苏糖2g/L、明矾0.5g/L、果糖二磷酸钠2g/L、六偏磷酸钠0.4g/L、溶剂为水，PH7.4。在缓冲液中加入牛血清白蛋白2.0g/L、乙二胺四乙酸二钠4.0g/L、PEG80002.8g/L、叠氮钠1.8g/L、氯化钠2.0g/L，搅拌混合均匀，即得试剂A；(2)试剂B的制备：将LBP抗体进行4℃透析，再用缓冲液2将LBP抗体稀释至2mg/ml，得到LBP抗体稀释液；将聚苯乙烯胶乳微球用蒸馏水离心、洗涤3次；用缓冲液2(氨基丁三醇缓冲液75mmol/L，PH7.2)将经过上步洗涤后的聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1％，再加入质量浓度为0.02％-0.1％的EDC，在室温下搅拌反应30min，反应结束后15000rpm离心洗涤以除去未反应的EDC，然后加入上步得到的LBP抗体稀释液，室温下搅拌反应30min，再加入终止液终止反应，将得到的反应液15000rpm离心，用缓冲液2(氨基丁三醇缓冲液75mmol/L，PH7.2)洗涤沉淀，重复离心洗涤3次，最后加入缓冲液2(氨基丁三醇缓冲液75mmol/L，PH7.2)、加入PEG80002.8g/L、叠氮钠1.8g/L、牛血清白蛋白2.0g/L、乙二胺四乙酸二钠4.0g/L、氯化钠2.0g/L，搅拌混合均匀即得试剂B。(3)按照需要的脂多糖结合蛋白参考校准品浓度将相应的脂多糖结合蛋白标准品分别加入上述缓冲液，制备得到不同浓度的一组校准品。步骤二，全自动生化仪参数设置；(a)检测波长：主波长为600nm，副波长为none；(b)检测温度：37℃；(c)反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂B后立即测定读取吸光度M1，5分钟后读取吸光度M2，计算吸光度变化ΔM＝M2-M1；(d)反应方向：负方向2CN109507127A权利要求书2/2页步骤三，检测操作；(a)取200ul试剂A与5ul血清样本(避免溶血)混匀；(b)将混匀后的溶液在37℃孵育时间5min；(c)再加入50ul试剂B，立即测定读取吸光度M1，5分钟后读取吸光度M2，计算吸光度变化ΔM＝M2-M1。步骤四，通过校准曲线计算出样本中脂多糖结合蛋白LBP的含量；3.如权利要求1所述用于检测人类血液中LBP含量的试剂盒，其特征在于，所述甘氨酸的制备方法如下：(1)