一种土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109541173A(43)申请公布日2019.03.29(21)申请号201811284335.5(22)申请日2018.10.31(71)申请人浙江大学地址310013浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号(72)发明人林道辉胡超(74)专利代理机构杭州天勤知识产权代理有限公司33224代理人胡红娟(51)Int.Cl.G01N33/24(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图2页(54)发明名称一种土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法(57)摘要本发明公开了一种土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，该方法包括：将用于分离秀丽隐杆线虫的器皿分成左、右两个区域，分别为大肠杆菌培养区和土壤放置区；向大肠杆菌培养区内加入固体培养基，并在固体培养基上接种大肠杆菌；培养大肠杆菌一段时间后，向土壤放置区内加入含有秀丽隐杆线虫的土壤，静置3～5h，利用秀丽隐杆线虫对大肠杆菌的趋食性，使线虫从土壤放置区爬至大肠杆菌培养区；取出固体培养基，冲洗固体培养基表面，收集得到秀丽隐杆线虫。本发明利用线虫的趋食性，对线虫进行分离，可使线虫从土壤中自由爬出取食，不仅操作简便，可进行大批量分离，而且能够在保持线虫生物活性的同时大大提高秀丽隐杆线虫的回收率。CN109541173ACN109541173A权利要求书1/1页1.一种土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，包括以下步骤：(1)将用于分离秀丽隐杆线虫的器皿分成左、右两个区域，分别为大肠杆菌培养区和土壤放置区；向大肠杆菌培养区内加入固体培养基，并在固体培养基上接种大肠杆菌；(2)培养大肠杆菌一段时间后，向土壤放置区内加入含有秀丽隐杆线虫的土壤，静置3～5h，利用秀丽隐杆线虫对大肠杆菌的趋食性，使秀丽隐杆线虫从土壤放置区爬至大肠杆菌培养区；(3)取出器皿内含有秀丽隐杆线虫的固体培养基，冲洗固体培养基表面，收集得到秀丽隐杆线虫。2.如权利要求1所述的土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，其特征在于，步骤(1)中，所述固体培养基为NGM培养基，其组成为：琼脂或琼脂替代品25g/L，蛋白胨20.0g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁1mol/L，氯化钙1mol/L，磷酸钾1mol/L，胆固醇乙醇溶液5mg/L，其余为超纯水。3.如权利要求1所述的土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coliOP50。4.如权利要求1所述的土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，其特征在于，步骤(1)中，先将大肠杆菌接入LB溶液中预培养后，再接种至固体培养基上；其中，预培养时间为11～13h，接入固体培养基时的接种量为1.2×108～1.8×108CFU/ml。5.如权利要求1所述的土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，其特征在于，步骤(2)中，加入土壤后，采用透气薄膜封住器皿顶部的开口，再进行静置。6.如权利要求1所述的土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，其特征在于，步骤(3)中，采用M9溶液进行冲洗；所述M9溶液的组成为：5.8g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，1.0g/L氯化铵，其余为超纯水。7.如权利要求1所述的土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，其特征在于，所述器皿的中部设有可拆卸的隔板；步骤(2)中，在加入固体培养基和土壤后，先取出隔板，再进行静置。8.如权利要求1所述的土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，其特征在于，在加入固体培养基和土壤后，在大肠杆菌培养区对应的培养皿外底面上安装支撑件，使器皿倾斜放置，提升培养皿大肠杆菌培养区一侧的高度；倾斜角度为5～15°。2CN109541173A说明书1/6页一种土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法技术领域[0001]本发明涉及一种土壤中线虫的分离方法，尤其涉及一种简易、保持生物活性和高分离率的秀丽隐杆线虫的分离方法。背景技术[0002]线虫是土壤生态系统的重要功能组分，在有机质分解、植物营养矿化及养分循环过程中起着重要作用。由于线虫的类群和数量丰富，很多物种可以在极端条件下生存，所以可以利用线虫结构简单、身体透明、易于观察、繁殖周期短和对污染物反应敏感等生物学特征进行环境毒性物质评价，线虫有着其它模式生物无法比拟的优势，是生态毒理学研究的理想材料，可以来判断土壤污染程度，评估污染对农田土壤健康的危害程度，从生态功能上揭示土壤环境的健康状况，进而为评价土壤污染提供理论依据。[0003]William等(WilliamsPL,DusenberyDB.AquaticToxicityTestingUsingtheNematodeCaenorhabditiselegans.EnvironmentalToxicologyandChemistry,1990,9:1285-1290.)最早以C.elegens作为模式生物，证实了运动和摄