一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109680035A(43)申请公布日2019.04.26(21)申请号201910146926.4(22)申请日2019.02.27(71)申请人上海市食品药品检验所地址200120上海市浦东新区张衡路1500号(72)发明人张宁范迪范一灵杨燕闻宏亮秦峰刘浩(74)专利代理机构上海申新律师事务所31272代理人俞涤炯(51)Int.Cl.C12Q1/04(2006.01)C12Q1/06(2006.01)权利要求书2页说明书9页附图6页(54)发明名称一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法及其应用(57)摘要本发明涉及一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其将待筛选菌种活化后制备接种菌悬液，并分别置于含有肌醇和不含肌醇的培养体系中，采用酶标仪实时检测，判断菌种的生长特异性，在不含肌醇的培养体系中无明显生长的为肌醇缺陷型菌株。本发明还涉及一种肌醇缺陷型菌株在食品中肌醇测定的方法，其包括配制肌醇缺陷型菌株悬液；配制肌醇标准溶液，以进行标准曲线的制作；处理待测样品，以用于配制待测样品溶液，并在待测样品溶液中加入肌醇缺陷型菌株悬液，以根据标准曲线进行待测样品中肌醇含量的测定。本发明成功筛选到一株肌醇缺陷型菌株，进一步利用该菌建立了一种食品中肌醇含量测定的微生物方法，该测定方法具有良好的精密度，回收率及重现性。CN109680035ACN109680035A权利要求书1/2页1.一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：将待筛选菌种活化后制备接种菌悬液，并将所述接种菌悬液分别置于含有肌醇和不含肌醇的培养体系中，采用酶标仪实时检测，判断菌种的生长特异性，在不含肌醇的培养体系中无明显生长的菌株为肌醇缺陷型菌株。2.根据权利要求1所述的肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其特征在于，所述含有肌醇的培养体系中的肌醇浓度为1～10μg/mL。3.根据权利要求1所述的一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其特征在于，所述待筛选菌种包括酿酒酵母菌和葡萄汁酵母菌；所述肌醇缺陷型菌株包括酿酒酵母S.cerevisiaeCICC32249和葡萄汁酵母S.uvarumCICC1465。4.根据权利要求3所述的一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其特征在于，还包括步骤：对所述肌醇缺陷型菌株的培养时间、测定准确率、培养终点进行验证，以确定用于肌醇测定的肌醇缺陷型菌株；其中，所述用于肌醇测定的肌醇缺陷型菌株为葡萄汁酵母S.uvarumCICC1465。5.根据权利要求4所述的一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其特征在于，用于肌醇测定的肌醇缺陷型菌株在培养至终点时间隔2h测定吸光度；其中，连续两次吸光度的差值在0.05之内，终止培养。6.一种权利要求1～5中任一项所筛选的肌醇缺陷型菌株在测定食品中肌醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)配制肌醇缺陷型菌株悬液；步骤2)配制肌醇标准溶液，以用于配制标准曲线用溶液，并在所述标准曲线用溶液中加入所述肌醇缺陷型菌株悬液，以进行标准曲线的制作；步骤3)处理待测样品，以用于配制待测样品溶液，并在所述待测样品溶液中加入所述肌醇缺陷型菌株悬液，以根据所述标准曲线进行待测样品中肌醇含量的测定。7.根据权利要求6所述的测定食品中肌醇的方法，其特征在于，所述肌醇缺陷型菌株悬液的配制步骤包括：将肌醇缺陷型菌株活化后接种到培养基上，培养2～3天后，制成贮备菌种，贮于冰箱中；在使用的前一天将贮备菌种转接到培养基中，培养20h～24h；取培养基培养物，在无菌条件下离心，倾去上清液；加入已灭菌的生理盐水重新分散细胞，快速混合均匀，离心倾去上清液；重复离心和清洗步骤后，细胞分散液用生理盐水悬浮，制成混悬液；550nm波长下测定所述混悬液的透光率，调整加入的菌液量或者氯化钠溶液使所述混悬液透光率在60％～80％，获得肌醇缺陷型菌株悬液。8.根据权利要求6所述的测定食品中肌醇的方法，其特征在于，所述肌醇标准溶液的配制步骤包括：取肌醇标准品干燥24h以上，称取预订量的肌醇标准品，用水充分溶解，定容至预定容量的棕色容量瓶中，贮存在冰箱中，获得预定浓度的肌醇标准储备液；并采用所述肌醇标准储备液配制肌醇标准中间液和肌醇标准工作液。9.根据权利要求6所述的测定食品中肌醇的方法，其特征在于，所述待测样品的处理步骤包括：称取预定量的样品，加入盐酸溶液，混匀；在灭菌釜中水解；取出，冷却至室温，加入氢2CN109680035A权利要求书2/2页氧化钠溶液，冷却；用适宜浓度的氢氧化钠溶液或盐酸溶液调pH至4.5～6，定容，混匀，过滤，收集滤液，调整其稀释倍数，使待测液肌醇的浓度在0.1μg/mL～1.0μg/mL范围内，作为试样提取液。10.根据权利要求6所述的测定食品中肌醇的方法，其特征在于，所述待测样品溶液和所述标准