一种牛奶中黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109752554A(43)申请公布日2019.05.14(21)申请号201711074402.6(22)申请日2017.11.05(71)申请人江苏维赛科技生物发展有限公司地址212009江苏省镇江市丁卯新区国家科技园B11栋3楼(72)发明人杜道林薛永来(51)Int.Cl.G01N33/577(2006.01)权利要求书1页说明书6页(54)发明名称一种牛奶中黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫试剂盒(57)摘要本发明公开了一种检测牛奶中黄曲霉毒素M1的时间荧光分辨荧光免疫分析试剂盒。所述检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒是由多孔包被板、缓冲液、黄曲霉毒素M1标准品、黄曲霉毒素M1的抗体冻干品、铕标记的羊抗鼠抗体、洗涤液和增强液所组成。所述检测黄曲霉毒素M1的时间荧光免疫分析试剂盒的检测方法包括下列步骤：(1)免疫原的制备；(2)包被原的制备；(3)单克隆抗体的制备；(4)样品的前处理及检测。本发明检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，检测成本低，同时具有检测特异性强，批内和批间差异小、灵敏度高和操作简单快速，且特别适合于大批量样品的检测等优点。CN109752554ACN109752554A权利要求书1/1页1.一种检测牛奶中黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：由多孔包被板，缓冲液，黄曲霉毒素M1标准品，黄曲霉毒素M1的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。2.一种根据权利要求1所述检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理，其特征在于：(1)将黄曲霉毒素M1与牛血清白蛋白偶联，得到免疫原；(2)将黄曲霉毒素M1与卵血清蛋白偶联，得到包被原；(3)用步骤(1)的免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(4)以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；(6)将动物组织先经过酸解提取后，再过MAX柱净化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物；(7)将步骤(6)的待检物进行测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的黄曲霉毒素M1黄曲霉毒素M1含量。3.根据权利要求1所述检测黄曲霉毒素M1的时间荧光免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述的固相载体是多孔包被板，采用96孔的多微孔包被板作为固相载体。4.根据权利要求1所述检测黄曲霉毒素M1的时间荧光分辨免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述的衍生试剂是丁胺。5.根据权利要求1所述检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述的催化剂是腈基磷酸二乙酯。6.根据权利要求1所述检测黄曲霉毒素M1的时间荧光免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述步骤(6)和(7)具体为取包被有黄曲霉毒素M1-OVA的微孔包被板，加入50µL处理好的样品到各自的微孔中，加入50µL以缓冲液稀释的黄曲霉毒素M1抗体，25~37℃振荡0.5~1小3+时，洗涤液洗三次，加以缓冲液稀释的100µLEu-羊抗鼠抗体，25~37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗六次，加200µL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的黄曲霉毒素M1含量。2CN109752554A说明书1/6页一种牛奶中黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫试剂盒技术领域[0001]本发明属于生物检测领域，具体的说，涉及一种检测牛奶中黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒。背景技术[0002]黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是真菌的次级代谢产物，主要是由黄曲霉（A.flavus）、寄生曲霉（A.parasiticus）和集蜂曲霉（A.nonius）一些菌株产生的；黄曲霉的产毒能力由于菌株的不同而差异甚大；寄生曲霉的所有菌株都能产生黄曲霉毒素。黄曲霉毒素是一种毒性很强的肝毒素，可引起肝脏的急性或慢性损害，它与乙肝病毒被认为是肝癌的最主要的两大诱因；除损害机体的肝脏以外，黄曲霉毒素对肾脏等其他多种组织器官也能造成严重损害，更为严重的是黄曲霉毒素已被证实具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用。黄曲霉毒素广泛存在于花生、玉米、麦类、稻谷等谷物农产品中，在通心粉、调味品、牛奶和食用油等食品中也经常发现，严重危害人、畜、禽类健康。黄曲霉毒素B1被公认为是目前致癌力最强的天然物质，1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物。自从1961年发现黄曲霉毒素以来，黄曲霉毒素的种类越来越多。目前已分离鉴定出十二种，分别是黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M