检测杂色曲霉毒素的时间分辨荧光免疫试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113125736A(43)申请公布日2021.07.16(21)申请号201911397728.1(22)申请日2019.12.30(71)申请人镇江华维检测技术有限公司地址212009江苏省镇江市新区丁卯经十五路99号11幢(72)发明人洪霞秦悦(51)Int.Cl.G01N33/58(2006.01)G01N33/577(2006.01)G01N33/533(2006.01)权利要求书1页说明书5页(54)发明名称检测杂色曲霉毒素的时间分辨荧光免疫试剂盒(57)摘要本发明公开了一种检测杂色曲霉毒素的时间荧光分辨荧光免疫分析试剂盒。所述检测杂色曲霉毒素的时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒是由多孔包被板、缓冲液、杂色曲霉毒素标准品、杂色曲霉毒素的抗体冻干品、铕标记的羊抗鼠抗体、洗涤液和增强液所组成。所述检测杂色曲霉毒素的时间荧光免疫分析试剂盒的检测方法包括下列步骤：(1)免疫原的制备；(2)包被原的制备；(3)单克隆抗体的制备；(4)样品的前处理及检测。本发明检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，检测成本低，同时具有检测特异性强，批内和批间差异小、灵敏度高和操作简单快速，且特别适合于大批量样品的检测等优点。CN113125736ACN113125736A权利要求书1/1页1.一种检测杂色曲霉毒素的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：由多孔包被板，缓冲液，杂色曲霉毒素标准品，杂色曲霉毒素的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。2.一种根据权利要求1所述检测杂色曲霉毒素的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理，其特征在于：(1)将杂色曲霉毒素与牛血清白蛋白偶联，得到免疫原；(2)将杂色曲霉毒素与卵血清蛋白偶联，得到包被原；(3)用步骤(1)的免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗杂色曲霉毒素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(4)以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗杂色曲霉毒素的单克隆抗体(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；(6)将动物组织先经过酸解提取后，再过MAX柱净化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物；(7)将步骤(6)的待检物进行测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的杂色曲霉毒素杂色曲霉毒素含量。3.根据权利要求1所述检测杂色曲霉毒素的时间荧光免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述的固相载体是多孔包被板，采用96孔的多微孔包被板作为固相载体。4.根据权利要求1所述检测杂色曲霉毒素的时间荧光分辨免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述的衍生试剂是丁胺。5.根据权利要求1所述检测杂色曲霉毒素的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述的催化剂是腈基磷酸二乙酯。6.根据权利要求1所述检测杂色曲霉毒素的时间荧光免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述步骤(6)和(7)具体为取包被有杂色曲霉毒素-OVA的微孔包被板，加入50µL处理好的样品到各自的微孔中，加入50µL以缓冲液稀释的杂色曲霉毒素抗体，25~37℃振荡0.5~1小3+时，洗涤液洗三次，加以缓冲液稀释的100µLEu-羊抗鼠抗体，25~37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗六次，加200µL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的杂色曲霉毒素含量。2CN113125736A说明书1/5页检测杂色曲霉毒素的时间分辨荧光免疫试剂盒技术领域[0001]本发明属于生物检测领域，具体的说，涉及一种检测杂色曲霉毒素的时间分辨荧光免疫分析试剂盒。背景技术[0002]杂色曲霉毒素（ST）是致癌性真菌毒素之一。其毒性虽弱于黄曲霉毒素，但由于主要的产毒菌杂色曲霉、构巢曲霉等在食品饲料中分布广，产毒比例高，故对人、畜、家禽的危害不容忽视。杂色曲霉素(Sterigmatocystin)主要是杂色曲霉(Aspergillusversicolor)和构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的最终代谢产物，同时又是黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(AspergillusparasiticusSpeare)合成黄血霉毒素过程后期的中间产物。据报道，感染了杂色曲霉的玉米在27℃的环境下，21天可产生杂色曲霉毒素12g/kg以上。杂色曲霉毒素的大鼠经口LD50以mg/kg体重计，雄性为166、雌性为120，小鼠为800以上。猴经腹腔注射LDso为32。由LDso值可看出，灵长类(猴)对杂色曲霉毒素的敏感性比啮齿类高。杂色曲霉毒素引起的致死性病变主要为肝、肾实质器官坏死。杂色曲霉毒素具有致癌性，还可使枯草杆菌及小鼠细胞发生突变反应。ST在自然界中广泛存在，因