利用两步盐析萃取分离纯化噬菌体裂解液中噬菌体的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110484514A(43)申请公布日2019.11.22(21)申请号201910807570.4(22)申请日2019.08.29(71)申请人大连理工大学地址116024辽宁省大连市高新园区凌工路2号(72)发明人修志龙张志荣沈俊涛(74)专利代理机构大连东方专利代理有限责任公司21212代理人李银姬李馨(51)Int.Cl.C12N7/00(2006.01)C12N7/02(2006.01)权利要求书1页说明书9页(54)发明名称利用两步盐析萃取分离纯化噬菌体裂解液中噬菌体的方法(57)摘要本发明属于生物工程技术领域，提供了一种利用两步盐析萃取分离纯化噬菌体裂解液中噬菌体的方法。该方法为：将柠檬酸钠或磷酸氢二钾溶解于噬菌体裂解液中，加入乙酸乙酯等亲脂性有机溶剂，温和涡旋混合，分相形成上、中、下三相的三相体系，完成第一步盐析萃取；向第一步盐析萃取所得下相溶液中加入正丙醇等亲水性有机溶剂，进行第二步盐析萃取，噬菌体在中间相得到富集和纯化。本发明解决了目前噬菌体分离工艺中存在的噬菌体与细菌代谢物难以分离、成本高等问题。该方法工艺简单、分离时间短、回收率高、分离成本低、除杂率高，是一种很有工业应用前景的分离方法。CN110484514ACN110484514A权利要求书1/1页1.一种两步盐析萃取分离噬菌体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)制备含有噬菌体裂解液和可溶性盐的混合溶液；(2)将步骤(1)所得混合溶液与有机溶剂A混合，分相得到富含有机溶剂A的上相溶液、凝集中间相以及富含盐和噬菌体的下相组成的三相体系I；(3)将步骤(2)所得下相与有机溶剂B混合，分相得到富含有机溶剂B的上相溶液、富含噬菌体的凝集中间相以及富含盐、杂蛋白和内毒素的下相组成的三相体系II。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述噬菌体裂解液中噬菌体效价为106-1011pfu/mL、总蛋白浓度为400-800μg/mL、细菌浓度为104-106cfu/mL、内毒素浓度为1.2×104-1.4×105EU/mL。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述可溶性盐为柠檬酸钠或磷酸氢二钾中的一种，所述可溶性盐的加入量为所述三相体系I总质量的3％-20％。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述噬菌体裂解液是噬菌体侵染宿主菌后进行共培养而获得的。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述噬菌体为烈性噬菌体。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述有机溶剂A为乙酸乙酯、正丙醇、正癸醇、叔丁醇或正丁醇中的一种，所述有机溶液A的加入量为所述三相体系I总质量的10％-47％。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述有机溶剂B为正丙醇、正丁醇、叔丁醇或异丙醇中的一种，所述有机溶剂B的加入量为所述三相体系II总质量的10％-50％。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)和(3)中，所述分相的方式为离心分相或静置分相，在所述离心分相中，分相温度为0-40℃、相对离心力为500-5000g、时间为2-60min，在所述静置分相中，分相温度为4-30℃、时间为0.25-2h。2CN110484514A说明书1/9页利用两步盐析萃取分离纯化噬菌体裂解液中噬菌体的方法技术领域[0001]本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种利用盐析萃取技术分离纯化噬菌体裂解液中噬菌体的方法。背景技术[0002]21世纪以来，抗生素滥用引发的细菌耐药问题已成为全球性的公共卫生危机，新型抗生素的研发困境也导致临床上的抗菌治疗形势日趋严峻。据2016年英国政府报告称，预计至2050年，每年“超级细菌”导致的死亡人数将增至1000万人。抗生素危机使得多重耐药菌和泛耐药菌感染疾病的治疗正面临着无药可用的严峻形势，也使得开发一种强有力的、具有适应症人群大、临床效果显著、不同于现有的独特杀菌机制、成本低、易于保存和使用等特点的抗菌治疗手段成为当务之急。[0003]噬菌体因其巨大的抗菌潜力将有望成为治疗耐药细菌感染类疾病的抗生素替代品。烈性噬菌体可以特异性识别宿主细菌，短时间内指数增殖并裂解宿主细菌，释放大量子代噬菌体并杀死细菌。另外，噬菌体拥有与抗生素完全不同的抗性机制，因此两者不存在交叉耐药性。美国食品与药物管理局(FDA)2016年和2019年先后批准了人体外用和静脉给药的噬菌体疗法临床试验，标志着世界最大医药市场的监管路径已经对噬菌体疗法开放。[0004]工业上噬菌体的制备包括宿主培养、噬菌体感染宿主和噬菌体分离纯化三大步骤。作为一种高价值生物产品，噬菌体下游的分离纯化非常