一种重组蛋白油乳剂亚单位疫苗的破乳方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111228859A(43)申请公布日2020.06.05(21)申请号202010126855.4(22)申请日2020.02.28(71)申请人山东信得科技股份有限公司地址262233山东省潍坊市诸城市开发区舜耕路信得工业园申请人青岛信得药业有限公司(72)发明人单学强张伦于泽坤栾志舫只勇郝光恩杨海明段笑笑(74)专利代理机构青岛海昊知识产权事务所有限公司37201代理人曾庆国(51)Int.Cl.B01D17/04(2006.01)A61K39/12(2006.01)A61P31/14(2006.01)权利要求书1页说明书6页(54)发明名称一种重组蛋白油乳剂亚单位疫苗的破乳方法(57)摘要本发明是提供一种重组抗原蛋白亚单位疫苗的破乳方法，是将使用油乳剂作为佐剂的亚单位疫苗在冰浴上进行超声破乳；其中超声破乳，一种具体条件如下：1000-2500焦耳，超声2-5秒，停止2-5秒，共30-45个循环，超声结束后在室温条件下离心获得水相。本发明的方法简便、迅速，可在10分钟内完成；抗原分离效果好，同时可保证法氏囊病毒VP2蛋白的稳定性；破乳后分离出的水相中的VP2抗原含量可以采用琼脂扩散试验法进行检测；破乳后水相中抗原回收率高，达40％。适用于对marcol52佐剂乳化的鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗和其他基因工程亚单位疫苗进行破乳，进而对水相进行内毒素含量检测，从而评价成品疫苗的内毒素含量。CN111228859ACN111228859A权利要求书1/1页1.一种重组抗原蛋白亚单位疫苗的破乳方法，其特征在于，所述的方法是将使用油乳剂作为佐剂的亚单位疫苗在冰浴上进行超声破乳。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超声破乳，其超声条件如下：1000-2500焦耳，超声2-5秒，停止2-5秒，共30-45个循环，超声结束后在室温条件下离心获得水相，完成破乳操作。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的超声破乳的条件如下：1500焦耳，超声4秒，停止4秒，共40个循环。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心条件如下：8000rpm/min离心10min。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组抗原蛋白亚单位疫苗为传染性法氏囊VP2蛋白疫苗。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的佐剂为marcol52。2CN111228859A说明书1/6页一种重组蛋白油乳剂亚单位疫苗的破乳方法技术领域[0001]本发明属于疫苗质量检测技术领域，具体为一种基因工程亚单位油乳剂灭活疫苗的破乳方法。背景技术[0002]传染性法氏囊病发病率高且病程短，传播迅速，病鸡严重腹泻、极度虚弱并有不同程度死亡，雏鸡感染后还可导致免疫抑制，并可诱发多种疫病或导致疫苗免疫失败。各品种的鸡均能感染，潜伏期2～3天。主要发生于2～15周龄的鸡，以3～6周龄为发病高峰期，近年来，该病发病日龄有增宽的趋势，从10日龄至产蛋的鸡群均有发生本病的报道。典型发病鸡群病初可见个别鸡突然发病，精神沉郁，食欲减退，羽毛蓬松，翅下垂，闭目，1～2天内可波及全群。病鸡腹泻，排出白色稀粪，随着病情的发展，病鸡出现畏寒、扎堆，严重者垂头、卧地不起，极度虚弱直至死亡。非典型病例主要见于老疫区或有一定免疫力的鸡群，症状不典型，主要引起免疫抑制，病鸡多出现食欲不振、进行性消瘦和腹泻等症状。传染性法氏囊病病毒属RNA病毒，病毒颗粒为球形，无囊膜，核衣壳为二十面体立体对称，直径为55～65纳米，其基因组由两个片段的双股RNA构成。该病毒有5种衣壳蛋白，即VP1～VP5，其中VP2是病毒的主要保护性抗原。[0003]传染性法氏囊病给家禽业造成巨大的经济损失，目前尚无特效药可以治疗，主要应用疫苗进行预防，所用疫苗主要为灭活疫苗和冻干活疫苗以及新型的基因工程亚单位疫苗。中等毒力活疫苗虽然能够抵抗IBDV超强毒株的攻击,但会对鸡的法氏囊产生一定的损伤。另外,使用活疫苗还存在病毒重组和毒力返强的风险。利用大肠杆菌表达系统进行外源蛋白的表达具有明显的优点，如操作方便简捷，成本低，易于工业批量生产，生长周期短，自身背景蛋白清晰。基因工程亚单位疫苗具有较好的免疫原性，副作用相对较小。因此安全、高效、可靠、廉价的基因工程亚单位疫苗成为应用前景广阔的传染性法氏囊病疫苗。[0004]内毒素存在于革兰氏阴性细菌细胞壁的外层，主要成分为脂多糖。当细菌处在生活状态时，它与菌体结合在一起不被释放，只有当细菌死亡、自溶或人为破坏时(如冻融、加热、超声波作用或药物浸提)，才能释放到环境中。一方面，它可以引起机体发热、白细胞增多，甚至休克死亡；另一方面，具有佐剂作用，可诱导多种细胞因子的表达，使机体非特异性免疫反应增强