一种蒜头果蛋白的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111909234A(43)申请公布日2020.11.10(21)申请号202010849015.0(22)申请日2020.08.21(71)申请人南京康齐生物科技有限公司地址211300江苏省南京市高淳区经济开发区花山路17号(72)发明人谈满良李小冬(74)专利代理机构苏州吴韵知识产权代理事务所(普通合伙)32364代理人王铭陆(51)Int.Cl.C07K1/14(2006.01)C07K1/36(2006.01)C07K1/34(2006.01)C07K1/16(2006.01)权利要求书1页说明书4页(54)发明名称一种蒜头果蛋白的制备方法(57)摘要一种蒜头果蛋白的制备方法，具体的步骤包括：（1）蛋白质提取；（2）提取液中加入有机溶剂和无机盐，搅匀，调节pH，收集富集相；（3）收集到的富集相，采用膜过滤，收集截留液；（4）将截留液上凝胶柱，洗脱，收集活性成分。本发明提出的蒜头果蛋白的制备方法采用两相萃取的提取纯化方式对蒜头果蛋白进行提取纯化，萃取条件温和，收率高达90%以上，同时蛋白质能够保留非常高的活性，且纯度也在90%以上，最高可达99.3%。CN111909234ACN111909234A权利要求书1/1页1.一种蒜头果蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）蛋白质提取；（2）提取液中加入有机溶剂和无机盐，搅匀，调节pH，收集富集相；（3）收集到的富集相，采用膜过滤，收集截留液；（4）将截留液上凝胶柱，洗脱，收集活性成分。2.根据权利要求1所述的一种蒜头果蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的蛋白质提取方式为蒜头果加入水低温打浆，离心获得上清液，沉淀中再次加水打浆，离心获得上清液，合并两次上清液，即为步骤（2）中所述的提取液。3.根据权利要求2所述的一种蒜头果蛋白的制备方法，其特征在于：所述的打浆温度为4-8℃，离心速度为4000-12000rpm，加入的水量为蒜头果果肉重量的10倍。4.根据权利要求1所述的一种蒜头果蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的有机溶剂为PEG、乙醇、甲醇、异丙醇中的一项或几项，无机盐为磷酸氢二钾、碳酸钠、柠檬酸钠、硫酸铵及柠檬酸铵中的一种或几项。5.根据权利要求1所述的一种蒜头果蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的有机溶剂的添加量为16-24%，无机盐的添加量为16-18%。6.根据权利要求1所述的一种蒜头果蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的pH值为4-8，使用的调节剂为浓度为0.5-1mol/L的盐酸。7.根据权利要求1所述的一种蒜头果蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2）中收集的富集相为上相，收集的温度为4-30℃。8.根据权利要求1所述的一种蒜头果蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的膜过滤采用的膜的孔径为1nm-0.05μm，操作压力为0.1-0.5Mpa。9.根据权利要求1所述的一种蒜头果蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的凝胶柱的型号为sephadesG-75，洗脱液为50-60mmol/Ltris-HCl，收集活性部分为第II和III部分。10.根据权利要求9所述的一种蒜头果蛋白的制备方法，其特征在于：所述的活性部分采用蒸馏水透析，收集透析内液低温冷冻干燥，温度为-50-10℃，即得高纯度蒜头果蛋白。2CN111909234A说明书1/4页一种蒜头果蛋白的制备方法技术领域[0001]本发明属于生物材料加工领域，具体涉及一种蒜头果蛋白的制备方法。背景技术[0002]蒜头果(MalaniaoleiferaChunetS.Lee)又名马兰后、咪民、猴子果、山桐果等，常绿乔木，属铁青树科(Olacaceae)蒜头果属，是我国特有单种属稀有植物。蒜头果是国家二级保护树种，广西重点保护野生植物，仅分布于广西西部和云南东南部的狭窄地带，生长于石灰岩的山坡、山脚杂木林中土壤湿润肥沃的地方。国外无蒜头果资源也未见有关蒜头果的研究报道，国内植物学家对蒜头果研究的历史也很短，直到1980年，广西植物研究所的李树刚教授才正式发表蒜头果的拉丁名为Malaniaoleifera，并将其置于铁青树科。[0003]杨敏采用粉碎、磷酸盐缓冲溶液浸提、硫酸铵沉淀、疏水色谱层析等分离手段,从蒜头果种仁中分离纯化蒜头果蛋白，并对其相对分子质量、氨基酸组成、等电点、中性糖含量、自由巯基含量、细胞活性等进行分析。结果表明：蒜头果蛋白是一种糖蛋白，含有18种氨基酸，等电点为4.6，相对分子质量为61875Da，由A、B2条链通过二硫键连接而成，蒜头果蛋白对Hela和Vero细胞具有强烈的细胞毒性。袁燕等对蒜头果的蛋白进行了研究，蒜头果种子经粉碎、抽提、硫酸铵沉淀、疏水层析