一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112625110A(43)申请公布日2021.04.09(21)申请号201910902739.4C07K1/18(2006.01)(22)申请日2019.09.24C07K1/16(2006.01)C07K1/14(2006.01)(71)申请人泰州医药城国科化物生物医药科技有限公司地址225300江苏省泰州市药城大道一号(创业路东侧、园南路北侧)新药创制基地二期C幢大厦12-15层(72)发明人梁鑫淼叶贤龙钱子俊郭志谋肖思佳闫竞宇(74)专利代理机构南京瑞弘专利商标事务所(普通合伙)32249代理人孙峰(51)Int.Cl.C07K14/47(2006.01)C07K1/20(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图2页(54)发明名称一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法(57)摘要本发明公开了一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法，包括a)样品预处理：采用低温离心去脂和等电点沉淀除去乳清蛋白，得酪蛋白粗样；b)离子交换色谱纯化：收集洗脱馏分进行SDS-PAGE电泳及HPLC分析检测，合并纯度高于80%的酪蛋白馏分；c)高效反相色谱精细纯化：对步骤b)中合并的酪蛋白馏分进行反相色谱纯化制备，收集各洗脱峰馏分，采用SDS-PAGE电泳及HPLC分析检测，合并纯度高于95%的β-酪蛋白馏分；d)脱盐及干燥处理：采用G25凝胶色谱对步骤c)中合并的β-酪蛋白馏分进行脱盐处理，对脱盐后样品进行干燥处理，得β-酪蛋白冻干粉。本发明方法收率高、稳定性好、条件温和且易于放大生产，另外也能够为后续研究β-酪蛋白及乳品中标准蛋白检测提供高纯度对照品。CN112625110ACN112625110A权利要求书1/1页1.一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a)样品预处理：取新鲜牛乳液或溶解的牛乳粉，低温高速离心除去乳脂，采用0.5~1M乙酸调节pH至酪蛋白等电点，室温下静置产生沉淀，低温离心取出沉淀物并加入缓冲液混匀、离心，取上清液过滤膜，得酪蛋白粗样；b)离子交换色谱纯化：将所述酪蛋白粗样上样到平衡缓冲液处理好的离子交换色谱柱上，上样后用平衡缓冲液继续淋洗色谱柱，待280nm吸收值至基线，使用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱馏分进行SDS-PAGE电泳及HPLC分析检测，合并纯度高于80%以上的酪蛋白馏分；c)高效反相色谱精细纯化：对步骤b）中合并的酪蛋白馏分进行高效反相色谱纯化制备，收集各洗脱峰馏分，采用SDS-PAGE电泳及HPLC分析检测，合并纯度高于95%的β-酪蛋白馏分；d)脱盐及干燥后处理：采用G25凝胶色谱对步骤c）中合并的β-酪蛋白馏分进行脱盐处理，对脱盐后的样品进行干燥处理，得β-酪蛋白冻干粉。2.根据权利要求1所述的一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法，其特征在于，所述步骤a)中，取新鲜牛乳液或溶解的牛乳粉，在4℃条件下离心10000rpm，15min，除去乳脂，采用0.5~1M乙酸调节pH至4.5-4.7，室温下静置30min产生沉淀，在4℃条件下离心10000rpm，15min，取出沉淀物并加入pH7.5的20mM磷酸钠缓冲液或者加入pH7.5的20mMTris-HCl缓冲液，混匀、离心，取上清液过滤膜，得酪蛋白粗样。3.根据权利要求1所述的一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法，其特征在于，所述步骤b)中，离子交换色谱纯化所用的分离材料基质为琼脂糖或高分子聚合物；粒径为30-100μm；＋＋＋配基的基团为-CH2N(CH3)3或-OCH2CH2NH(CH2CH3)2或-CH2CHOHCHH2NH(CH2CH3)2。4.根据权利要求1所述的一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法，其特征在于，所述步骤b)中，离子交换色谱纯化过程中平衡缓冲液的电导率为0-10mS/cm、pH为7.5-9.0；洗脱缓冲液的电导率为10-90mS/cm、pH为7.5-9.0；洗脱方式为等度洗脱和/或梯度洗脱；梯度洗脱：流动相中盐浓度电导率在10-100min内由20mS/cm变为90mS/cm，洗脱体积为柱体积的3-8倍。5.根据权利要求1所述的一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法，其特征在于，所述步骤c)中，高效反相色谱精细纯化所用的填料基质为硅胶或高分子聚合物；填料配基的碳原子数为4-20的正链烷基中的一种或多种；填料粒径为5-80μm，孔径为200-500Å，比表面积为2100~500m/g；色谱柱内径为4.6-1600mm，柱床高度为50-1000mm。6.根据权利要求1所述的一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法，其特征在于，所述步骤c)中，高效反相色谱精细纯化中上样量为色谱固定相重量的0.01-20%；色谱的上样和洗脱流速为50-200cm/h；