一种用于提取微量新鲜外周血有核细胞蛋白的方法及其专用装置.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113462518A(43)申请公布日2021.10.01(21)申请号202110764088.4(22)申请日2021.07.06(71)申请人中国人民解放军军事科学院军事医学研究院地址100071北京市海淀区太平路27号院申请人北京蛋白质组研究中心(72)发明人应万涛杨丽王明超翁爽(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人赵静(51)Int.Cl.C12M1/00(2006.01)C12N5/078(2010.01)权利要求书2页说明书5页附图4页(54)发明名称一种用于提取微量新鲜外周血有核细胞蛋白的方法及其专用装置(57)摘要本发明公开了一种用于临床微量新鲜外周血制备PBMC蛋白的方法，该方法操作简单，且在血液起始量低的情况下蛋白回收率能达到后续分析要求。本方法实现了提取20μL～120μL新鲜外周血PBMC蛋白，较大程度上减少了所需临床新鲜外周血样本体积和病患负担。CN113462518ACN113462518A权利要求书1/2页1.一种蛋白质组学微量血液样品制备装置，其特征在于：是以一封闭底部尖头的200μL的移液枪头作为提取PBMC的分离容器。2.权利要求1所述蛋白质组学微量血液样品制备装置的制备方法，包括以下步骤：(a)将200μL移液枪头尖头底部封闭，以制备细长的分离反应池PBMC‑mCap；(b)清洗PBMC‑mCap：待PBMC‑mCap封闭冷却后，使用乙腈清洗PBMC‑mCap，即得所述蛋白质组学微量血液样品制备装置。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(a)中，封闭尖头底部的方法包括使用酒精灯外焰迅速封闭移液枪枪头底部、或者使用其他能封闭移液枪头底部的方法，包括直接生产封闭底部移液枪枪头和附有移液枪头盖的方式。4.一种提取微量血液样品中外周血单个核细胞的方法，包括下述步骤：(1)在权利要求1所述的蛋白质组学微量血液样品制备装置中加入常温密度梯度离心液，分别将血液样品用PBS缓冲液体积比1：1稀释后平铺于所述常温密度梯度离心液表面；(2)离心分离PBMC：用封口膜封闭所述蛋白质组学微量血液样品制备装置的顶部，并置于离心机中，离心；(3)分离PBMC层：先用200μLPipetteTip移液枪枪头移除上层血浆与血小板，再用新的PipetteTip移液枪枪头取PBMC层置于1.5mL离心管中；(4)裂红：在含PBMC的离心管中加入1mL红细胞裂解液，摇晃后，冰上静置后离心，裂解PBMC中残留的红细胞；(5)清洗PBMC：离心后用移液枪小心移除上清液体，再加入1mLPBS缓冲液离心，最后移除上清；(6)收集PBMC：在清洗后的PBMC中加入PBS缓冲液，再离心，移除所有上清，收集沉淀，即得。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述密度梯度离心液为氯化铵红细胞裂解液(STEMCELL)；所述血液样品与所述密度梯度离心液的体积比为1：0.5‑2；加入所述血液样品的体积可在20μL～120μL，加入血液样品和密度梯度离心液总体积小于300μL；所述血液样品为新鲜外周血，优选为取出体内24h的新鲜外周血。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述离心的条件为：1180g离心10min。7.根据权利要求4‑6中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述红细胞裂解液为氯化铵红细胞裂解液；所述步骤(4)中，加入红细胞裂解液后，不可反复剧烈摇晃PBMC混悬液，轻微摇晃后必须静置10min；所述离心的条件为：300g离心8min。8.根据权利要求4‑7中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，移液枪移除的表面液体根据离心后PBMC分布的高度决定，第一次移除上清液体不小于800μL，第二次移除上清不小于1ml。9.根据权利要求4‑8中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，移除所有上清时使用200μL的PipetteTip移液枪枪头移除；所述200μL的PipetteTip移液枪枪头不可碰到底部PBMC沉淀；所述离心的条件为：300g离心8min。2CN113462518A权利要求书2/2页10.根据权利要求4‑9中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，所述PBS缓冲液的用量为200μL；所述离心的条件为：1200g离心5min；所述步骤(1)、(5)、(6)中所述PBS缓冲液的PH为7.3～7.5。3CN113462518A说明书1/5页一种用于提取微量新鲜外周血有核细胞蛋白的方法及其专用装置技术领域[0001]本发明属于蛋白质组领域，具体涉及一种蛋白质组学微量样品制备方法，该方法操作简单快捷，在微量血液样品中外周血单核细胞蛋白