一种纳豆激酶的分离纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114250216A(43)申请公布日2022.03.29(21)申请号202111586604.5(22)申请日2021.12.23(71)申请人浙江工业大学地址310014浙江省杭州市拱墅区潮王路18号(72)发明人欧志敏程朋朋卢媛王金美张楚玥(74)专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司33201代理人黄美娟李世玉(51)Int.Cl.C12N9/56(2006.01)C07K1/18(2006.01)C07K1/34(2006.01)C07K1/14(2006.01)权利要求书2页说明书10页附图3页(54)发明名称一种纳豆激酶的分离纯化方法(57)摘要本发明公开了一种纳豆激酶的分离纯化方法，将纳豆激酶粗品用缓冲液溶解后过滤，滤液作为上样液进行DEAE‑SephadexA‑50阴离子交换柱层析；上样结束后，先以0.1M、pH7.4的磷酸缓冲液进行洗脱，洗脱速度10s/滴，采用色谱工作站监测流出液，出峰前按每10min/管收集，出峰处每个峰收集，洗脱至流出液不出峰；合并含有纳豆激酶蛋白和酶活的流出液，超滤，滤液冻干，即为纳豆激酶纯酶。本发明方法简化了纯化步骤，降低了纯化过程中酶的损失，大幅缩减纯化所需时间和成本，电泳纯纳豆激酶，比活达到了90080.6U/mg，纯化倍数为3.2，酶活回收率为82.62％。CN114250216ACN114250216A权利要求书1/2页1.一种纳豆激酶的分离纯化方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：(1)纳豆基质：将大豆用清水清洗，室温浸泡后，控干水分，获得预处理后的大豆；将预处理后的大豆与NaCl和蔗糖混合后灭菌，即为纳豆基质，40‑60℃保温；所述NaCl用量以预处理后的大豆质量计为2‑4g/100g；所述蔗糖用量以预处理后的大豆质量计为2‑5g/100g；(2)纳豆发酵：将蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)CGMCCNo12336经扩大培养的种子液接种至步骤(1)制备的40‑60℃的纳豆基质中，30‑40℃恒温发酵培养30‑40h，发酵物于4℃放置8‑12h后，获得纳豆发酵产物；(3)纳豆激酶粗品：将步骤(2)纳豆发酵产物冻干并粉碎，获得纳豆冻干粉；将纳豆冻干粉和生理盐水混匀，4℃放置过夜，离心，弃去沉淀，上清液抽滤，滤液即为纳豆激酶提取液，冻干后，得纳豆激酶粗品；(4)阴离子交换柱层析：将步骤(3)纳豆激酶粗品用缓冲液溶解后过滤，滤液作为上样液进行阴离子交换柱层析；所述阴离子交换柱层析采用DEAE‑SephadexA‑50阴离子交换层析树脂为层析介质；上样结束后，先以0.1M、pH7.4的磷酸缓冲液进行洗脱，洗脱速度10s/滴，采用色谱工作站监测流出液，出峰前按每10min/管收集，出峰处每个峰收集，洗脱至流出液不出峰；然后采用含0.2‑1mol/LNaCl的0.1mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲液以NaCl浓度0.2mol/L的幅度增加进行梯度洗脱，每个浓度的洗脱速度均为10s/滴，出峰前按每10min/管收集流出液，洗脱至流出液不出峰；合并含有纳豆激酶蛋白和酶活的流出液，超滤，滤液冻干，即为纳豆激酶纯酶。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)种子液体积接种量以纳豆基质重量计为0.02‑0.05mL/g。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)种子液按如下方法制备：从蜡样芽孢杆菌CGMCCNo12336斜面中挑取一环到种子培养液中，在37℃、180rpm下震荡培养16h，获得种子液；所述种子培养液质量配方为：蛋白胨1.5％、氯化钠1％、酵母粉0.5％，溶剂为水，pH7.0。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)纳豆冻干粉是指将纳豆发酵产物倒入平板中于‑20℃预冻6h后，用冻干机在‑53℃真空冷冻干燥过夜，后使用粉碎机打碎成粉。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)生理盐水体积用量以纳豆冻干粉质量计为10‑20mL/g。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)所述上样液是将纳豆激酶粗品用0.1M、pH7.4的磷酸缓冲液溶解后用0.45μm水系滤头过滤，取滤液即为上样液；所述磷酸缓冲液体积用量以纳豆激酶粗品质量计为10‑30mL/g。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)上样液上样速度为10s/滴，上样量为0.02‑0.06个柱体积。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)0.1M、pH7.4的磷酸缓冲液洗脱方法为：上样结束后，用0.1M、pH7.4的磷酸缓冲液进行洗脱，洗脱速度为10s/滴，利用色谱工作站监测流出液，0‑62.4min未出峰处流出液按10min/管收集，然后分别收集62.5‑66.7min、66.8‑68.3mi