一种裂解昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解液和裂解方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114350621A(43)申请公布日2022.04.15(21)申请号202111656368.X(22)申请日2021.12.31(71)申请人苏州博腾生物制药有限公司地址215000江苏省苏州市苏州工业园区新平街388号腾飞创新园3号楼(72)发明人章成昌张骥孙永越李杰张雅张劲松孔令洁钱浩(74)专利代理机构苏州新知行知识产权代理事务所(特殊普通合伙)32414代理人郑丽玲(51)Int.Cl.C12N7/02(2006.01)权利要求书2页说明书8页(54)发明名称一种裂解昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解液和裂解方法(57)摘要本发明提供一种昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解液、裂解液获取方法及细胞裂解方法，通用性地对含AAV1～13等多种血清型的细胞中进行高效原位裂解，宿主细胞包括昆虫细胞和哺乳动物细胞，收率95%以上，全程操作无需转移料液或离心等，细胞裂解后，经过深层过滤或切向流过滤获得AAV细胞澄清液，具有收率高的特点，获得AAV细胞澄清液还可用于后续层析提纯，该方法可用于生产上大规模线性放大的收获rAAV细胞澄清液。CN114350621ACN114350621A权利要求书1/2页1.一种昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解液，其特征在于：所述裂解液的组分包括Tris、MgCl2、Tween20和NaCl，配制的裂解液中各组分为：Tris‑HCL50mMMgCl21‑5mMNaCl0.3‑0.6MTween200.5‑2%配制的裂解液pH值为7.6‑8.3。2.一种昆虫细胞及哺乳动物细胞裂解液的获取方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：选取多种经典裂解试剂配制含有不同组分、不同浓度的缓冲体系裂解液；步骤2：将含有腺相关病毒的细胞收获液加入到不同组分的缓冲体系裂解液中进行裂解，控制料液的转速、温度和pH值，在裂解过程的不同时段进行取样；步骤3：检测裂解前后料液的细胞活率、浊度和AAV滴度，根据检测结果选取出对细胞裂解具有促进作用裂解试剂作为配制裂解液的初选组分；步骤4：改变初选组分中不同裂解试剂的浓度，进行裂解效果的比较，检测裂解后料液的细胞活率、密度、滴度、pH和电导，根据检测结果进一步筛选，并且确定出不同裂解试剂的摩尔浓度；其中，腺相关病毒选自AAV1~13中任意一种或多种。3.如权利要求2所述的昆虫细胞及哺乳动物细胞裂解液的获取方法，其特征在于：步骤1中选取的经典裂解试剂包括Tris、Tween20、Poloxamer188、NaCl、Sodiumdeoxycholate、MgCl2、TritonX‑100中的一种或几种。4.如权利要求2所述的昆虫细胞及哺乳动物细胞裂解液的获取方法，其特征在于：步骤3中的特征参数包括细胞活率、浊度、AAV滴度、细胞密度、pH值、电导中的一种或多种。5.一种昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：裂解前取样20ml含有腺相关病毒的细胞收获液检测初始细胞活率、浊度和细胞密度；步骤2：将细胞收获液定量；步骤3：打开超净工作台的照明与通风开关，在超净工作台中用电动移液枪添加裂解液与核酸酶到细胞收获液中，在37℃，100‑200rpm的裂解条件下，裂解1‑3h；步骤4：对裂解后的料液进行深层过滤或切向流过滤获得AAV细胞澄清液。6.如权利要求5所述的昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解方法，其特征在于：步骤3中添加裂解液包括配制裂解母液和顺序添加裂解试剂两种方式，其中，裂解母液方式，首先，将裂解试剂按照浓度和比例配制成裂解母液，然后再按比例将裂解母液添加到细胞收获液中；顺序添加裂解试剂方式：首先，准备好需要添加的裂解试剂，然后按照先后顺序将各种裂解试剂添加至细胞收获液中。7.如权利要求5所述的昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解方法，其特征在于：所述核酸酶的加入量为5‑50U/ml。8.如权利要求5所述的昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解方法，其特征在于：步骤4中深层过滤的方法，将裂解后收获的样品直接进行一、二级膜包深层过滤，过滤压力≤14psi，2CN114350621A权利要求书2/2页当压力大于14psi时，停止上样并用缓冲液顶洗20L/m2；根据剩余料液体积，换上新的一、二级深层过滤膜包，并将两次收获的料液混合后进行0.2um或0.45um滤膜过滤。9.如权利要求8所述的昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解方法，其特征在于：所述深层过滤的方法具体包括以下步骤：步骤4.1：根据滤器载量和所需过滤体积计算所需一级过滤膜包和二级过滤膜包的面积；步骤4.2：将一级过滤膜包和二级过滤膜包安装在滤器的管路上，并在一级过滤膜包和二级过滤膜包的进口管道上安装压力检测器，在一级过滤膜包的进液口连接注射水，在一级过滤膜包的出液口连接废液