一种人凝血因子IX纯化的亲和层析缓冲液体系及纯化方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115896074A(43)申请公布日2023.04.04(21)申请号202211633934.X(22)申请日2022.12.19(71)申请人成都蓉生药业有限责任公司地址610000四川省成都市高新区起步园科园南路7号(72)发明人余伟李伟梁洪余鼎陈川卢杨利黄琰洪树青(74)专利代理机构成都高远知识产权代理事务所(普通合伙)51222专利代理师肖柯岑全学荣(51)Int.Cl.C12N9/64(2006.01)权利要求书2页说明书9页(54)发明名称一种人凝血因子IX纯化的亲和层析缓冲液体系及纯化方法(57)摘要本发明提供了一种特定组成的亲和层析缓冲液体系，包括亲和层析洗涤液和亲和层析洗脱液；所述亲和层析洗涤液是含有如下组分的pH为6.5～7.4的水溶液：0.1～0.2mol/L氯化钠、0.01～0.02mol/L枸橼酸钠；所述亲和层析洗脱液是含有如下组分的pH为7.0～8.0的水溶液：0.3～0.6mol/L氯化钠、0.02～0.03mol/L枸橼酸钠、0.015～0.035mol/L盐酸精氨酸；使用本发明亲和层析缓冲液体系纯化人凝血因子IX，通过精简的纯化步骤即可获得收率和比活力高的人凝血因子IX，具有很好的推广应用前景。CN115896074ACN115896074A权利要求书1/2页1.一种人凝血因子IX纯化的亲和层析缓冲液体系，其特征在于，包括亲和层析洗涤液和亲和层析洗脱液；所述亲和层析洗涤液是含有如下组分的水溶液：0.1～0.2mol/L氯化钠、0.01～0.02mol/L枸橼酸钠；所述亲和层析洗脱液是含有如下组分的水溶液：0.3～0.6mol/L氯化钠、0.02～0.03mol/L枸橼酸钠、0.015～0.035mol/L盐酸精氨酸；所述亲和层析洗涤液的pH为6.5～7.4；所述亲和层析洗脱液的pH为7.0～8.0。2.如权利要求1所述的亲和层析缓冲液体系，其特征在于，所述亲和层析洗涤液是以如下组分为添加剂的缓冲液：0.15mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠；所述亲和层析洗脱液是以如下组分为添加剂的缓冲液：0.35mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠、0.025mol/L盐酸精氨酸；所述亲和层析洗涤液的pH为7.4；所述亲和层析洗脱液的pH为7.0。3.如权利要求1或2所述的亲和层析缓冲液体系，其特征在于，还包括亲和层析平衡液，所述亲和层析平衡液为含有0.01～0.03mol/L枸橼酸钠，pH为7.0～8.0的水溶液，优选为以0.03mol/L枸橼酸钠为添加剂，pH为7.4的缓冲液。4.权利要求1～3任一项所述的亲和层析缓冲液体系在人凝血因子IX纯化过程中的应用。5.一种人凝血因子IX纯化方法，其特征在于，包括亲和层析步骤，所述亲和层析步骤使用权利要求1～3任一项所述的亲和层析缓冲液体系进行。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述亲和层析步骤包括：(a)装填肝素亲和凝胶于层析柱，使用亲和层析平衡液平衡4～5倍柱体积；(b)上样待亲和层析的人凝血因子IX样品，使用亲和层析平衡液洗涤，并用亲和层析洗涤液洗涤；(c)用亲和层析洗脱液洗脱，从洗脱液出现具有280nm紫外吸收峰产物时开始收集1～1.5倍柱体积的洗脱液。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述的肝素亲和凝胶是HeparinBestaroseFF、CaptoHeparin、HeparinsepharoseFF、UW90AgaroseHeparin或HeparinAgaroseFF；步骤(b)所述待亲和层析的人凝血因子IX样品温度调节为6.0～10.0℃；上样流速为25～150cm/h；所述亲和层析平衡液洗涤和亲和层析洗涤液洗涤的流速为25～150cm/h；步骤(c)所述亲和层析洗脱液洗脱的流速为25～150cm/h。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述的肝素亲和凝胶是HeparinBestaroseFF；使用所述亲和层析平衡液平衡5倍柱体积；步骤(b)所述待亲和层析的人凝血因子IX样品温度调节为10.0℃；上样流速为150cm/h；所述亲和层析平衡液洗涤和亲和层析洗涤液洗涤的流速为150cm/h；步骤(c)所述亲和层析洗脱液洗脱的流速为150cm/h。9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)预纯化；(2)S/D病毒灭活；(3)二次离子交换层析；(4)二次超滤透析；(5)亲和层析；2CN115896074A权利要求书2/2页(6)纳米过滤；其中，步骤(1)包括取去冷沉淀的上清血浆经DEAESephadexA50凝胶进行柱层析和超滤透析的步骤；步骤(3)包括经阴离子交换凝胶进行柱层析的步骤，所述阴离子交换凝胶是Diamo