从冷冻保存细胞中回收活细胞的方法和装置.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106164253A(43)申请公布日2016.11.23(21)申请号201580015743.9(74)专利代理机构北京市金杜律师事务所(22)申请日2015.03.1311256代理人杨宏军(30)优先权数据2014-0623112014.03.25JP(51)Int.Cl.C12N5/00(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C12M1/00(2006.01)2016.09.22C12M3/02(2006.01)(86)PCT国际申请的申请数据C12N5/0735(2006.01)PCT/JP2015/0574732015.03.13C12N5/074(2006.01)(87)PCT国际申请的公布数据C12N5/0775(2006.01)WO2015/146631JA2015.10.01C12N5/0789(2006.01)C12N5/0797(2006.01)(71)申请人泰尔茂株式会社地址日本东京都(72)发明人赖纮一郎竹内凉平权利要求书1页说明书10页(54)发明名称从冷冻保存细胞中回收活细胞的方法和装置(57)摘要本发明提供在融化并回收冷冻保存细胞时能以高效率回收活细胞的方法及用于该方法的装置。通过下述方法解决了上述课题，所述方法为从冷冻保存细胞中回收活细胞的方法，其包括将冷冻保存细胞融化的步骤、和用稀释液对融化后的细胞悬浮液进行稀释的步骤，所述方法的特征在于，以稀释时的最大渗透压负荷为250mOsm/秒以下的方式进行稀释。CN106164253ACN106164253A权利要求书1/1页1.从冷冻保存细胞中回收活细胞的方法，所述方法包括将冷冻保存细胞融化的步骤、和用稀释液对融化后的细胞悬浮液进行稀释的步骤，所述方法的特征在于，以稀释时的最大渗透压负荷为250mOsm/秒以下的方式进行稀释。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以稀释时的最大渗透压负荷为50mOsm/秒以下的方式添加稀释液。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，以稀释时的最大渗透压负荷为40mOsm/秒～50mOsm/秒的方式添加稀释液。4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，细胞为骨骼肌成肌细胞。5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，稀释液包含：对将融化后的细胞悬浮液转移至其他容器后的冷冻保存容器进行冲洗而得的冲洗液。6.冷冻保存细胞融化装置，其包含：(i)动作部，所述动作部将稀释液注入；及(ii)运算控制部，所述运算控制部确定并控制动作部的稀释液注入速度。7.如权利要求6所述的装置，其还包含：(iii)测定部，所述测定部测定液体的渗透压。8.套件，所述套件包含用于不经增殖培养地制造片状细胞培养物的方法中的细胞、及培养基材，所述方法包括以能够在不使细胞实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度接种细胞的工序，所述套件中，细胞是利用权利要求1～5中任一项所述的方法回收的细胞。2CN106164253A说明书1/10页从冷冻保存细胞中回收活细胞的方法和装置技术领域[0001]本发明涉及在融化并回收冷冻保存细胞时能以高效率回收活细胞的方法及用于该方法的装置。背景技术[0002]近年来，为了修复损伤的组织等，进行了移植各种细胞的尝试。例如，为了修复因心绞痛、心肌梗塞等缺血性心脏病而导致损伤的心肌组织，尝试利用了胎儿心肌细胞、骨骼肌成肌细胞、ES细胞等。[0003]作为如上所述的尝试的一环，开发出了利用支架(scaffold)形成的细胞结构物、使细胞形成为片状而得的片状细胞培养物(例如，参见专利文献1～3)。[0004]关于片状细胞培养物在治疗中的应用，已开展了下述研究：针对由烧伤等导致的皮肤损伤的培养表皮片的利用、针对角膜损伤的角膜上皮片状细胞培养物的利用、针对食道癌内窥镜切除的口腔黏膜片状细胞培养物的利用等。[0005]由此，随着基于再生医疗的新治疗方法的确立，对自体细胞进行冷冻并保存，并在形成人工组织、片状细胞培养物等的三维结构体时，或者在直接移植细胞时，将上述的冷冻保存细胞融化并回收自体细胞，然后使用其进行治疗的机会近年来逐渐增加。[0006]对于细胞而言，通过在液氮内等进行冷冻，可以半永久性地保存，但是由于冷冻时产生的潜热、细胞内产生的冰晶等，细胞会受到损伤，在回收经冷冻保存的细胞时，不能全部作为活细胞被回收。通常，将冷冻保存细胞融化后，为了确保必要量的细胞，需要对融化后的细胞进行培养而使其增殖。但是，进行长时间培养需要劳力和时间，因此，为了削减所述的劳力和时间，期望回收尽可能多的活细胞。因此，通常进行下述尝试：对冷冻·融化方法进行研究以减少对细胞的物理性损伤，从而使活细胞数增多。[0007]现有技术文献[0008]专利文献[0