一种蓝铜肽的生物合成方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115850522A(43)申请公布日2023.03.28(21)申请号202211667566.0(22)申请日2022.12.23(71)申请人修实生物医药（南通）有限公司地址226000江苏省南通市崇川区唐闸镇街道永福路109号3幢101室(72)发明人吴寅嵩殷海兴谭莹莹金锋陈丽丽(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C07K5/083(2006.01)C07K1/18(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12P21/06(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表（电子公布）附图1页(54)发明名称一种蓝铜肽的生物合成方法(57)摘要本发明公开了一种蓝铜肽的生物合成方法，包括按照氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的重组蛋白，合成编码该重组蛋白的基因，利用其构建重组质粒，然后将其转入宿主菌中，发酵培养诱导蛋白表达，分离蛋白，进行酶切纯化，最后与铜离子进行络合，得到所述蓝铜肽。与现有技术相比，本发明蓝铜肽的生物合成方法，通过优化融合蛋白设计，获得结构和等电点特性更优的融合蛋白，能够显著提高终产物的产量，具有生产成本低，绿色环保，产量高的优势。CN115850522ACN115850522A权利要求书1/1页1.一种蓝铜肽的生物合成方法，其特征在于，包括按照氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的重组蛋白，合成编码该重组蛋白的基因，利用其构建重组质粒，然后将其转入宿主菌中，发酵培养诱导蛋白表达，分离蛋白，进行酶切纯化，最后与铜离子进行络合，得到所述蓝铜肽。2.根据权利要求1所述的蓝铜肽的生物合成方法，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，或者是根据密码子简并性得到的编码相同蛋白序列的其他核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的蓝铜肽的生物合成方法，其特征在于，所述表达质粒选自pET28a、pET30a或pETDuat‑1。4.根据权利要求1所述的蓝铜肽的生物合成方法，其特征在于，所述宿主菌选自大肠杆菌BL21(DE3)或JM109。5.根据权利要求1所述的蓝铜肽的生物合成方法，其特征在于，所述发酵培养诱导蛋白表达，采用的诱导剂为IPTG，浓度为0.3‑0.5mM，诱导的条件为2840℃，250350rp~~m诱导4~7h。6.根据权利要求1所述的蓝铜肽的生物合成方法，其特征在于，所述分离蛋白的方法包括：菌体破壁，离心收集包涵体蛋白，洗涤包涵体蛋白，重新溶解包涵体蛋白。7.根据权利要求1所述的蓝铜肽的生物合成方法，其特征在于，所述酶切工艺采用胰蛋白酶，酶切pH为8‑10，15‑35℃酶切4‑8h。8.根据权利要求1所述的蓝铜肽的生物合成方法，其特征在于，所述纯化方法采用离子交换柱层析纯化方法。9.根据权利要求1所述的蓝铜肽的生物合成方法，其特征在于，所述与铜离子进行络合，是采用含铜离子的铜络合剂进行络合，所述铜络合剂选自醋酸铜、氯化铜、二甲醇铜中的一种或几种。2CN115850522A说明书1/4页一种蓝铜肽的生物合成方法[0001]技术领域[0002]本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种蓝铜肽的生物合成方法。背景技术[0003]蓝铜肽(GHK‑Cu)是由铜离子和GHK三肽络合形成的一种化合物，其组成为甘氨酸‑组氨酸‑赖氨酸‑铜(glycyl‑L‑histidy1‑L‑lysine‑copper)，最初于1973年从人的血浆中分离而得，在医学上能够改善血液循环，促进神经和神经营养因子的合成，具有抗氧化性，抗炎症和治疗癌症等作用。1999年研究者认为铜肽及其铜修复物可以作为组织重塑的激活剂，同时也是一个信号肽，现主要用于皮肤护理产品中，促使皮肤上皮组织再生，恢复肌肤年轻、减少粗细皱纹与疤痕、改善肌肤弹性、使角质细胞和纤维姆细胞增生，更可以让皮下组织增厚，使肌肤不再脆弱敏感，增加皮肤弹性与韧度，也让保养品在脸上能被最大化的吸收利用。[0004]蓝铜肽的制备通常需要先合成或者制备GHK三肽，作为生物活性多肽，广泛用于实验和临床等目的。其大部分通过化学合成方式生产，其小规模短肽生产成本极高，且发展主要受到反应副产物过多、环境不友好、产率过低、反应底物和试剂价格过高等缺点的制约。基因工程技术成功生产了许多种蛋白。目前，通过基因工程生产蛋白主要步骤为分离目的基因，构建表达载体，在大肠杆菌宿主中生产蛋白，是一种非常高效生产相对分子量较大的蛋白的方法，但由于其针对短肽的表达量低，限制了其应用。如中国专利申请202011639055.9公开了一种重组蓝铜肽前体‑GHK三肽的高纯度制备方法，但是其使用的融合蛋白由于等电点较高，且三种底物氨基酸重复占比过高，导致蛋白表达量很低，GHK三肽产量只有17.56mg/L，没有产业化应用价值