非洲猪瘟病毒pK205R蛋白的哺乳动物细胞表达、单克隆抗体制备、表位鉴定及应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115850391A(43)申请公布日2023.03.28(21)申请号202211083911.6G01N33/577(2006.01)(22)申请日2022.09.06G01N33/543(2006.01)(71)申请人中国农业科学院上海兽医研究所地址201100上海市闵行区紫月路518号(72)发明人李丽薇高飞周艳君童光志乔思娜刘佳晨童武郭子强王树茂(74)专利代理机构北京市诚辉律师事务所11430专利代理师范盈(51)Int.Cl.C07K14/01(2006.01)C07K7/08(2006.01)C07K16/08(2006.01)G01N33/569(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称非洲猪瘟病毒pK205R蛋白的哺乳动物细胞表达、单克隆抗体制备、表位鉴定及应用(57)摘要本发明涉及一株针对ASFVK205R编码蛋白的哺乳动物293i细胞表达、单克隆抗体制备、表位鉴定及应用。通过构建真核表达载体pCDNA3.4‑K205R‑strep,瞬时转染293i细胞表达重组pK205R蛋白，纯化后免疫Balb/c小鼠，经过四次免疫后取小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合制备杂交瘤细胞，然后利用间接ELISA方法进行亚克隆获得抗pK205R蛋白的单克隆抗体，并确定该抗体所对应的抗原表位为2VEPREQFFQDLLSAV16。CN115850391ACN115850391A权利要求书1/1页1.一种猪ASFVpK205R蛋白的抗原表位，所述抗原表位可以特异性识别猪源ASFVpK205R蛋白。2.如权利要求1所述的一种猪ASFVpK205R蛋白的抗原表位，所述抗原表位为猪源pK205R蛋白2－16肽段，其氨基酸序列为2VEPREQFFQDLLSAV16，可用于IFA实验中ASFVpK205R蛋白和Westernblotting实验中还原状态下pK205R蛋白的检测。3.一种抗体制剂，所述抗体制剂包含特异性针对权利要求1或2中所述的ASFVpK205R蛋白的抗原表位的抗体，所述抗体是单克隆的；或所述制剂包含所述抗体的片段。4.权利要求3所述的抗体制剂，所述抗体制剂可以有效的诊断或检测ASFV。5.两种制备抗血清的方法，所述方法包括将权利要求1或2中所述的抗原表位给药至动物宿主以在所述动物宿主中产生抗体和回收包含在所述动物宿主中产生的抗体的抗血清。6.一种抗原组合物，所述抗原组合物包含至少一种抗原，其中所述至少一种抗原包含ASFVpK205R蛋白的至少部分蛋白或多肽且所述至少部分蛋白或多肽包含至少一种猪ASFVpK205R蛋白的抗原表位或抗原决定簇。7.如权利要求6所述的抗原组合物，所述的猪ASFVpK205R蛋白的抗原表位为猪ASFVpK205R蛋白2－16肽段，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示(2VEPREQFFQDLLSAV16)。8.权利要求1或2所述的一种猪ASFVpK205R蛋白的抗原表位、权利要求3或4所述的抗体制剂、权利要求6、7所述的抗原组合物在制备诊断或检测ASFV的ELISA抗体检测试剂盒中的应用。2CN115850391A说明书1/8页非洲猪瘟病毒pK205R蛋白的哺乳动物细胞表达、单克隆抗体制备、表位鉴定及应用技术领域[0001]本发明涉及生物学领域，具体提供了一种猪非洲猪瘟病毒pK205R蛋白的293i细胞表达、单克隆抗体制备、表位鉴定及应用。背景技术[0002]非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)自2018年传入我国以来，给养猪业带来了惨重的经济损失。目前，仍没有商业化疫苗用于该病的防控。非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)作为该病病原，是一种有囊膜的DNA病毒，病毒粒子呈二十面体结构，基因组大小约为170～190kb，可以编码至少200种病毒蛋白。其中，与基因组复制、病毒组装、免疫逃逸、致病传播相关的蛋白常被关注，例如p30、p54、p72、p17、pB602L、pK205R等。ASFVK205R编码序列在毒株之间高度保守，pK205R蛋白的早期弥漫性表达后期与病毒粒子的形成紧密联系，参与细胞重组以形成病毒工厂。pK205R蛋白作为主要抗原蛋白之一，它的反应原性较强，且是ASFV早期表达的抗原蛋白，故pK205R蛋白可作为ASFV早期检测的指标，对ASFV早期诊断意义重大。[0003]目前，有关ASFVK205R编码蛋白的功能研究和抗原表位的报道还很欠缺。本发明利用细胞融合及亚克隆筛选，成功制备一株针对ASFVK205R编码蛋白的单克隆抗体，并对其识别的抗原表位进行了鉴定，发现其特异性识别ASFVpK205R蛋白2－16肽段，序列为