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本发明公开了一种基于稀土掺杂上转换纳米材料荧光探针的制备方法,包括以下步骤:采用热分解法制备稀土掺杂上转换纳米材料NaY1?x?yF4:YbxTmy,式中,x、y为Yb3+、Tm3+分别掺杂Y3+位的摩尔比,0.15≤x≤0.25,0.002≤y≤0.01,所述上转换纳米材料的粒径为40?50nm;将稀土掺杂上转化纳米材料依次进行水溶性处理、羧基化蛋白包裹得到表面含有羧基基团的稀土掺杂上转换纳米材料;最后活化后与连接FAM的氨基化DNA探针相连得到具备荧光检测功能的荧光探针。该方法能提高UCNPs的水溶性和生物兼容性,易与生物分子连接,所制备得到的荧光探针发光性能优越、灵敏度高且特异性好。