副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌双重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110951902A(43)申请公布日2020.04.03(21)申请号202010015463.0C12R1/01(2006.01)(22)申请日2020.01.07(71)申请人河南科技大学地址471000河南省洛阳市涧西区西苑路48号(72)发明人汪洋东笑易力王少辉靳曼玉李金朋李小康孙理云(74)专利代理机构洛阳公信知识产权事务所(普通合伙)41120代理人王海龙(51)Int.Cl.C12Q1/689(2018.01)C12Q1/6851(2018.01)C12Q1/06(2006.01)C12R1/21(2006.01)权利要求书2页说明书8页序列表2页附图2页(54)发明名称副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌双重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法(57)摘要本发明提供了副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌双重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法，副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌的引物和探针分别根据副猪嗜血杆菌的16SrRNA基因和猪支气管败血波氏杆菌的fla基因设计并且合成，建立的副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌双重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法可以对上述两种细菌同时进行定性及定量的检测，相比现有的检测技术，减少了检测时间及检测成本；本发明的扩增效率高，检测过程中的灵敏度高、特异性强且具有良好的重复性，具有很高的可行性与应用前景，为病原微生物鉴定和降低养殖经济损失提供科学可靠的方法。CN110951902ACN110951902A权利要求书1/2页1.副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌双重荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于：引物的核苷酸序列为：副猪嗜血杆菌上游引物HPSQF：5’-GCGTAGTATCGGGAGATGAAAG-3’（SEQIDNO:1）；副猪嗜血杆菌下游引物HPSQR：5’-TAGAGATCGTCGGCTTGGTAGG-3’（SEQIDNO:2）；猪支气管败血波氏杆菌上游引物BBQF：5’-GGCTTCTTCAAACCGGGCAGCT-3’（SEQIDNO:3）；猪支气管败血波氏杆菌下游引物BBQR：5’-GTCGCAAACCTGCCGTAATCCAG-3’（SEQIDNO:4）；探针的核苷酸序列为：副猪嗜血杆菌特异探针HPSQP：5’-X1-ACCGCAAGGCCAGTTGCCATAAGAT-Y1-3’（SEQIDNO:5）；猪支气管败血波氏杆菌的特异探针BBQP：5’-X2-CCGCCCATCTGTAACATCGGACTT-Y2-3’（SEQIDNO:6）。2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌双重荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于：探针序列5’端标记的荧光基团X1和X2分别为FAM、HEX、CY5、JOE、ROX中的一种，且X1和X2互不相同，探针序列3’端标记的淬灭基团Y1和Y2分别为BHQ1、BHQ2、BHQ3中的一种。3.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌的引物和探针的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：具体步骤为：步骤一、计算副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌标准样品的基因组DNA拷贝数，将副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌标准样品分别稀释成106、105、104、103、102数量级拷贝数；步骤二、以步骤一得到的不同浓度的副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌基因组不同浓度的标准样品和提取的待测样品为模板，分别用权利要求1所述的引物HPSQF、HPSQR、BBQF和BBQR，及权利要求1或权利要求2所述的探针HPSQP和BBQP进行荧光定量PCR扩增反应；步骤三、根据荧光定量PCR扩增Cq值和反应荧光信号变化及强度，对待测样品中的副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌中的目标基因进行定性和定量分析。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤一和步骤二中，荧光定量PCR扩增反应体系包括：2×PremixExTaq(ProbeqPCR)10μL，引物HPSQF、HPSQR、BBQR和BBQF的终浓度分别为0.3μM，探针HPSQP和BBQP的终浓度分别为0.15μM，DNA模板2μL，双蒸水补足扩增反应体系至20μL。5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤一和步骤二中，荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性10s，56℃退火30s，循环40次。6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤三中，结果分析包括定性分析和定量分析，分析的具体过程为：1）定性分析：出现探针HPSQP5’端标记的荧光基团X1的荧光扩增曲线且Cq值＜35时，说明副猪嗜血杆菌阳性；出现探针BBQP5’端标记的荧光基团X2的荧光扩增曲线且