原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN101942511A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN101942511A(43)申请公布日2011.01.12(21)申请号201010259678.3(22)申请日2010.08.20(71)申请人华南理工大学地址510640广东省广州市天河区五山路381号(72)发明人叶宇鑫石磊(74)专利代理机构广州市华学知识产权代理有限公司44245代理人裘晖(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/04(2006.01)G01N21/64(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表2页附图3页(54)发明名称原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法及试剂盒(57)摘要本发明公开了一种原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法及试剂盒。本发明根据结核分枝杆菌gyrB基因保守区设计了四条特异性引物，应用这四条引物，同时结合原位荧光环介导恒温核酸扩增技术，能特异性地检测出结核分枝杆菌。本发明实现样品原位检测、无需增菌、特异性高，能在不到2小时完成扩增，最低检测极限达到10CFU/ml，标本的检出率达到99％。使用本发明所述的方法和试剂盒鉴定结核分支杆菌简便。CN109425ACCNN110194251101942516A权利要求书1/2页1.一种原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)设计引物：设计外引物1对和内引物1对，具体为：外引物1：5’-CAGCACGCTAATTACCCGG-3’；外引物2：5’-CGAGTTTGGTCATCAGCCG-3’；内引物1：5’-TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT-3’；内引物2：5’-Cy3-CTGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG-3’；(2)对被检样品进行处理：A、将被检样品中的菌体进行固定；B、增加固定后的菌体的细胞壁通透性；(3)环介导等温扩增反应：A、反应体系为：每25μl反应体系含有10pmol外引物1、10pmol外引物2、10pmol内引物1、10pmol内引物2、8单位BstDNA聚合酶和12.5微升LAMP反应缓冲液，双蒸去离子水补至25μl；所述LAMP反应缓冲液为10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4和5mMBetina按体积比8∶5∶2∶10配制；B、反应条件为：将配制好的反应体系滴加到步骤(2)处理好的菌体上，聚酯封层，63℃恒温反应2h；(4)样品复染：反应结束后，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染色，然后用无菌水中漂洗，晾干；(5)分析判断反应产物结果：置于荧光显微镜下观察，打开绿色光，在视野中看到激发红色荧光的细胞就是阳性结果，反之，绿色光激发下看不到的细胞即为阴性结果。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述将被检样品中的菌体进行固定，是通过以下步骤实现的：将待检测样品悬浮于磷酸缓冲液中，1000～1200rpm离心2～3分钟，取上清；10000～12000rpm离心3～4分钟沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞三次；10000～12000rpm离心3～4分钟后，在细胞沉淀中加入体积百分比4％的多聚甲醛，然后静置过夜；接着10000～12000rpm离心3～4分钟后，将细胞沉淀悬浮于磷酸缓冲液，得到细胞悬浮液；细胞悬浮液滴加到用质量百分比为0.03％的多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，生物安全柜中自然风干。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述将增加固定后的菌体的细胞壁通透性，是通过以下步骤实现的：将固定好的细胞分别依次置于体积百分比为50％、80％、100％浓度的乙醇液中各处理1分钟，进行脱水；再用溶菌酶、蛋白酶K、甘氨酸溶液和RNA酶依次处理。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述溶菌酶的使用浓度为0.5mg/ml，处理条件为室温下处理细胞45分钟；所述蛋白酶K的使用浓度为0.1μg/ml，处理条件为室温下处理细胞5分钟；所述甘氨酸的使用浓度为0.1mol/L，处理条件为室温下处理细胞30s；所述RNA酶的使用浓度为0.5mg/ml，处理条件为室温下处理20min。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述4′，6-二脒基-2-苯基2CCNN110194251101942516A权利要求书2/2页吲哚的使用浓度为1mg/ml。6.实现权利要求1～5任一项所述方法的试剂盒，包括引物、酶、通透性处理试剂、缓冲液和染料，其特征在于：所述的引物由一对外引物和一对内引物组成，具体为：外引物1：5’-CAGCACGCTAATTACCCGG-3