试剂盒及其用途.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN104561350A(43)申请公布日2015.04.29(21)申请号201510043696.0(22)申请日2015.01.28(71)申请人深圳华大基因研究院地址518083广东省深圳市盐田区北山工业区综合楼(72)发明人赵艳敏王晓宏朱家楼夏伟成侯强华桑邹婧(74)专利代理机构北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙)11201代理人李志东(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12M1/34(2006.01)权利要求书5页说明书19页C12R1/32(2006.01)序列表4页附图6页(54)发明名称试剂盒及其用途(57)摘要本发明公开了试剂盒及其用途，该试剂盒包含：第一引物组，其特异性识别结核分支杆菌的KatG基因，由第一引物对和第二引物对组成；第二引物组，其特异性识别结核分支杆菌的RpoB基因，由第三引物对和第四引物对组成；第三引物组，其特异性识别结核分支杆菌的RpsL基因，由第五引物对和第六引物对组成；以及第四引物组，其特异性识别结核分支杆菌的embB基因，由第七引物对和第八引物对组成。利用该试剂盒能够对待测结核分枝杆菌KatG、RpoB、RpsL和embB基因核酸序列进行富集，进而通过对富集序列进行文库构建、测序和分析，能够确定上述基因预定位点是否存在突变，并判定结核分枝杆菌对各基因对应药物是否具备耐药性。CN104561350ACN104561350A权利要求书1/5页1.一种试剂盒，其特征在于，包含：第一引物组，所述第一引物组特异性识别结核分支杆菌的KatG基因，由第一引物对和第二引物对组成，所述第一引物对具有SEQIDNO.1-2所示的核酸序列，所述第二引物对具有SEQIDNO.3-4所示的核酸序列；第二引物组，所述第二引物组特异性识别结核分支杆菌的RpoB基因，由第三引物对和第四引物对组成，所述第三引物对具有SEQIDNO.5-6所示的核酸序列，所述第四引物对具有SEQIDNO.7-8所示的核酸序列；第三引物组，所述第三引物组特异性识别结核分支杆菌的RpsL基因，由第五引物对和第六引物对组成，所述第五引物对具有SEQIDNO.9-10所示的核酸序列，所述第六引物对具有SEQIDNO.11-12所示的核酸序列；以及第四引物组，所述第四引物组特异性识别结核分支杆菌的embB基因，由第七引物对和第八引物对组成，所述第七引物对具有SEQIDNO.13-14所示的核酸序列，所述第八引物对具有SEQIDNO.15-16所示的核酸序列。2.一种对待测结核分支杆菌预定基因预定位点进行突变检测的方法，所述预定基因预定位点为选自结核分支杆菌的KatG基因315位点、RpoB基因526和531位点、RpsL基因43和88位点、以及embB基因306位点的至少之一，其特征在于，包括：利用权利要求1所述的试剂盒富集待测结核分支杆菌预定基因的核酸序列；针对富集得到的核酸序列，构建核酸测序文库；对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果；基于所述测序结果，确定待测结核分支杆菌预定基因的序列信息；以及基于所述待测结核分支杆菌预定基因的序列信息，确定所述待测结核分支杆菌的预定基因预定位点是否存在突变。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用所述试剂盒中特异性识别所述结核分支杆菌预定基因的引物组，从待测结核分支杆菌的核酸样本富集所述待测结核分支杆菌预定基因的核酸序列，其中，当预定基因为KatG基因时，利用第一引物对对待测结核分支杆菌的核酸样本进行第一轮PCR扩增，然后以第一轮PCR扩增产物为模板，利用第二引物对进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增产物即为富集得到的待测结核分支杆菌预定基因的核酸序列；当预定基因为RpoB基因时，利用第三引物对对待测结核分支杆菌的核酸样本进行第一轮PCR扩增，然后以第一轮PCR扩增产物为模板，利用第四引物对进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增产物即为富集得到的待测结核分支杆菌预定基因的核酸序列；当预定基因为RpsL基因时，利用第五引物对对待测结核分支杆菌的核酸样本进行第一轮PCR扩增，然后以第一轮PCR扩增产物为模板，利用第六引物对进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增产物即为富集得到的待测结核分支杆菌预定基因的核酸序列；当预定基因为embB基因时，利用第七引物对对待测结核分支杆菌的核酸样本进行第一轮PCR扩增，然后以第一轮PCR扩增产物为模板，利用第八引物对进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增产物即为富集得到的待测结核分支杆菌预定基因的核酸序列。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，按照25μl反应体系计算，所述第一轮2CN104561350A权利要求书2/5页PCR扩增的反