细胞学实验报告6-Hela细胞凋亡诱导及检测.pdf

细胞学实验报告六Hela细胞凋亡诱导及检测生96华以超2009030049细胞学实验报告六Hela细胞凋亡诱导及检测生96华以超2009030049同组姓名：赵宇实验日期：2010.11.12-13一、实验原理：细胞凋亡(apoptosis)或程序化细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)，是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，并强调这一过程是一种自然的生理学过程。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以又被称为程序化细胞死亡。通过细胞凋亡，机体得以消除不再需要的细胞，而不引起炎症反应。细胞凋亡有确保正常生长、发育，维持内环境稳定，发挥积极的防御功能的作用。凋亡过程中的细胞在形态学和很多生化指标上与正常细胞和坏死的细胞都有明显区别（表1）：表1.细胞凋亡和细胞坏死的区别区别点细胞凋亡细胞坏死起因生理或病理性病理性变化或剧烈损伤范围单个散在细胞大片组织或成群细胞细胞膜保持完整，一直到形成破损凋亡小体染色质凝聚在核膜下呈半月状呈絮状细胞器无明显变化肿胀、内质网崩解细胞体积固缩变小肿胀变大凋亡小体有，被邻近细胞或巨噬无，细胞自溶，残余碎片细胞吞噬被巨噬细胞吞噬基因组DNA有控降解，电泳图谱呈随机降解，电泳图谱呈涂梯状抹状蛋白质合成有无调节过程受基因调控被动进行炎症反应无，不释放细胞内容物有，释放内容物。Hoechst33258为特异性DNA染料，与A-T键结合，但在pH2.0环境下则优先与RNA结合，染色DNA时应调整染液的pH至7.0，这种染料不溶于磷酸缓冲液；所以配制时必须先以蒸馏水溶解配成储存液在4℃中避光保存。1/4细胞学实验报告六Hela细胞凋亡诱导及检测生96华以超2009030049二、实验步骤：1．细胞凋亡的诱导⑴Hela细胞传代培养16h后，镜下观察细胞状态：细胞边缘为多边形并聚集形成细胞岛，可推断细胞此时为贴壁生长；⑵向培养皿内加入200μLH2O2溶液（母液浓度为8.8mmol/L，终浓度为0.8mmol/L），轻轻晃动将其混合均匀（滴加溶液时要轻，不要冲击细胞层）；⑶放回37℃、5％CO2条件温箱继续培养。2．DAPI染色⑴镜检观察细胞形态与贴壁情况；⑵收集细胞：吸去培养基，用PBS用洗涤后，加入200μl胰酶37℃消化至细胞多数变圆（约2min左右）；⑶加入1mLPBS，吹吸至细胞由底部脱落；⑷将细胞培养液转至1.5mLEP管中，1000rpm离心5min；⑸吸出上清，于沉淀中加入100μl甲醇，重悬细胞后，室温固定10min；⑹1000rpm离心5min弃上清，加100μlPBS洗涤沉淀细胞；⑺1000rpm离心5min后弃上清，加入适量DAPI染液于37℃避光染色10min；⑻1000rpm离心5min后弃上清，加入100μlPBS洗涤；⑼1000rpm离心5min后弃上清，加入适量PBS重悬细胞，使细胞密度适宜观测；⑽取15μl细胞悬液于玻片上并于正置荧光显微镜下观察，选取典型凋亡阶段的细胞拍照。三、实验结果：1．未经H2O2诱导的细胞对照（图1，感谢韩笑同学）图1未经H2O2诱导的Hela细胞（10*？），即未凋亡的正常细胞2/4细胞学实验报告六Hela细胞凋亡诱导及检测生96华以超20090300492．经H2O2诱导过的Hela细胞（图2）图2经H2O2诱导过的Hela细胞（10*40）图2a开始固缩的细胞，体积较周围细胞小，染色明显图2b边缘开始出现芽体图2c边集状态，并有形成凋亡小体的趋势四、实验分析与小结：同HE染色，细胞凋亡实验做得仍然是艰辛曲折，可能是同时在一起做有些手忙脚乱的缘故吧。其实不管是HE染色还是细胞凋亡的观察我拿到的细胞都是很多的，可惜我没有好好利用起来，或者说我把这么好的实验条件给糟蹋了。3/4细胞学实验报告六Hela细胞凋亡诱导及检测生96华以超2009030049有两个地方，一个是甲醇重悬细胞的时候，我加完甲醇上了闹铃就干别的事情去了，时间到了就去离心，离心完了才发现：EP管底部根本就没有细胞——因为细胞全部附着在管壁，厚厚一层！无奈之下只好小心翼翼地把细胞吹下去，重新泡10min，再离心——这样一来又耽误了15min，而且效果还不是很好。第二是加入DAPI后，我没有注意到需要避光染色！以至于10min后发现这一点只好又重新染了几分钟。当时没意识到这个问题的严重性，于是待制片时，虽然有黏黏糊糊一大坨细胞，但颜色却几乎没染上——好在制片时没有取完所有的细胞，结果只好重新进行染色——虽然结果算是弥补了，但是照相却还要重新排队，当时真是有种欲哭无泪的感觉！由于时间比较匆忙，于是当时并没有细细挑选好看的细胞，只是随便拍了一张就离开了。但之后看来效果还算说得过去吧。同时也惊叹