细胞凋亡诱导与检测.docx

Hela细胞凋亡诱导与检测生92盛心磊2009012337周四班同组同学：王璇实验目的：学习掌握细胞凋亡的原理以及诱导凋亡的方法。了解DAPI染色的原理、方法并用它检验细胞凋亡。实验器材显微镜、移液器、离心机、显微镜、载玻片、盖玻片、擦镜纸、显微摄影技术仪器、锡纸。实验试剂PBS溶液以成品干粉加超纯水配制；过滤后121ºC灭菌20min，4ºC保存H202溶液消化液：0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液DAPI染液实验步骤：细胞凋亡诱导将对数增长期的细胞用0.25%胰酶消化，调整细胞数为4×105/L，胞悬浮于100μLDMEM培养基。加H2O2处理，至终浓度为0.8mmol/L。（H2O2母液浓度8.8mol/L）24小时后收集细胞进行染色和形态学观察。细胞凋亡检测收集细胞(200uL胰酶37℃消化后，再加入1mL培养基)至1.5mLEP管，1000rpm离心5min。吸出上清，于沉淀中加入100uL甲醇溶液，室温固定10min。1000rpm离心5min。弃上清，加100uLPBS洗涤沉淀细胞。1000rpm离心5min。弃上清，加50uLDAPI，于37℃染色10min。1000rpm，离心5min。弃上清，加100uLPBS洗涤。1000rpm，离心5min。弃上清，加15uLPBS重悬细胞。取15uL悬液于玻片上并于正置荧光显微镜下观察。整理：实验结束后把桌面收拾干净，东西统一放回后面的台子上。用完显微镜要复原显微镜，如果用了油镜要擦拭镜头。实验结果：分裂期细胞细胞的凋亡检测：图1：细胞凋亡检测（图中标出的为处于分裂期的细胞）分裂中期细胞图2：细胞凋亡检测（图中标出的为处于分裂中期的细胞）实验初期，我在视野中观察到了很多如上图中标出的细胞，并误以为是凋亡细胞。但是观察发现，该类细胞并无特别致密且分散的蓝色荧光，高亮区域主要集中在中间，且过于密集。图2则更加明显，蓝色区域呈现出规则的纺锤形，在细胞中间还能够观察到排列整齐的染色体，说明该细胞正处于有丝分裂中期。经过老师确认后，这些细胞都是处于分裂期的细胞。通过对比分裂期的细胞，将其设为对照，处于凋亡stageIIb期的细胞我可以较清晰地分辨出凋亡细胞。图3：细胞凋亡检测（处于凋亡stageIIb期的细胞）处于凋亡stageIIb期的细胞图4：细胞凋亡检测（处于凋亡stageIIb期的细胞）处于凋亡stageIIa期的细胞图5：细胞凋亡检测（处于凋亡stageIIa期的细胞）如图3-5所示，图中标出的细胞处于凋亡的不同时期，说明之前细胞传代培养以及凋亡诱导的成功。本次观察到的凋亡细胞主要为IIa和IIb两个阶段。处于这两个阶段的细胞形态比较特殊，染色情况比较容易分辨。这两个阶段同有丝分裂的细胞有着较大的区别。首先，可以见到较为分散且数量较少的染色亮斑；其次染色较深的区域并没有集中在中央，呈弥散状，而是散布在细胞的各个位置；stageIIa的细胞中能够观察到明显的核形变化。受到染色时间、染液分布等问题的影响，我很难确定处于凋亡I期的细胞。由于在进行观察拍照前，细胞经过了多次离心，因此凋亡小体基本上被去除，很难观察到。分析与讨论：细胞凋亡的检测方法：1）形态学观察方法1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。2、丫啶橙（AO）染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。2）DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA电泳出现阶梯状（LADDER）条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。3）酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。4）流式细胞仪分析细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细