一种敲除ITGB3基因的细胞及其构建方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927457A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202210797489.4(22)申请日2022.07.08(71)申请人西南医科大学附属中医医院地址646699四川省泸州市龙马潭区春晖路182号(72)发明人李森谢明忠陈光友姜铧财李东东朱凯古钦文(74)专利代理机构重庆志合专利事务所(普通合伙)50210专利代理师胡荣珲(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)C12N5/10(2006.01)C12N15/12(2006.01)权利要求书1页说明书11页序列表6页附图5页(54)发明名称一种敲除ITGB3基因的细胞及其构建方法(57)摘要本发明提供一种敲除ITGB3的细胞的构建方法，包括：1)基于ITGB3基因的外显子序列选择若干靶点；2)针对所述靶点序列设计并合成对应的sgRNA单链序列对；3)将所述sgRNA单链序列对退火复性处理后插入到线性化载体，然后将所述线性化载体转染到靶细胞中；4)经筛选和鉴定，得到ITGB3敲除的细胞。本发明还提供了基于所述构建方法得到的敲除ITGB3的细胞。本发明提供的敲除ITGB3的细胞为在细胞、动物和分子水平上研究ITGB3异常表达与骨肉瘤耐药的关联提供了良好的细胞模型。CN115927457ACN115927457A权利要求书1/1页1.一种敲除ITGB3的细胞的构建方法，其特征在于，包括：1)基于ITGB3基因的外显子序列选择若干靶点；2)针对所述靶点序列设计并合成对应的sgRNA单链序列对；3)将所述sgRNA单链序列对退火复性处理后插入到线性化载体，然后将所述线性化载体转染到靶细胞中；4)经筛选和鉴定，得到ITGB3敲除的细胞。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述外显子序列基于核苷酸序列为SEQIDNO:1的转录本序列确定。3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述靶点位于3号外显子和/或4号外显子上，所述3号外显子的核苷酸序列为SEQIDNO:2，所述4号外显子的核苷酸序列SEQIDNO:3。4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述靶点的核苷酸序列为SEQIDNO:4和SEQIDNO:5中的一个或两个。5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA单链序列对选自第一sgRNA单链序列对和第二sgRNA单链序列对中的一个或两个；所述第一sgRNA单链序列对的核苷酸序列分别为SEQIDNO:6和SEQIDNO:7；所述第二sgRNA单链序列对的核苷酸序列分别为SEQIDNO:8和SEQIDNO:9。6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述线性化载体为pX459载体；所述靶细胞选自143B细胞系。7.基于如权利要求1‑6中任一种构建方法获得的ITGB3敲除的细胞。8.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述细胞中ITGB3基因缺失了至少一个外显子的全部或部分序列，使所述ITGB3基因不能表达。9.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述缺失的外显子为3号外显子和4号外显子中的一个或两个。2CN115927457A说明书1/11页一种敲除ITGB3基因的细胞及其构建方法技术领域[0001]本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种敲除ITGB3基因的细胞及其构建方法。背景技术[0002]骨肉瘤(osteosarcoma)是儿童和青少年最常见的原发恶性骨肿瘤，多见于长骨干骺端，细胞异质性高，近几十年来，通过手术切除结合多药辅助化疗，5年生存率提高到70％‑80％[1]。阿霉素(doxorubicin)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)是常用的辅助化疗药物，由于对这些药物的反应不佳，即使增加剂量或辅助其它药物，发生局部复发和转移的患者的5年生存率下降到了20％以下。既往研究提示，肿瘤细胞在接受一种化疗药物作用之后会变得对很多不同结构的化疗药物表现出广泛耐药，即多药耐药，因此，深入了解骨肉瘤细胞发生化疗耐药的分子机制，对于开发新的治疗方法，最终改善骨肉瘤患者的预后至关重要。[0003]整合素(integrins)作为细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的主要黏附受体，在细胞膜上广泛表达，整合素通过与其他细胞上的受体结合，或者与细胞外基质中的配体结合，激活多种信号转导通路，导致肿瘤细胞行为和微环境状态的改变方面发挥着重要的生物学作用。整合素激活还可以调节ECM的组装和迁移细胞的极性，从而介导肿瘤转移和非肿瘤细胞的浸润。事实上，微环境对细胞行为的影响可以通过细胞表面整合素的表达模式来确定，因此，整合素可以作为连接肿瘤细胞及其周围微环境的中枢家族(hubfamily)，β3整合素(β3integ