东莨菪内酯的酶法制备方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927500A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202211038918.6(22)申请日2022.08.29(71)申请人西南大学地址400715重庆市北碚区天生路2号申请人重庆中烟工业有限责任公司(72)发明人丁伟郭富友肖庆礼杨亮王建林袁明彭奎周红万凤琳简渝凡(74)专利代理机构北京中政联科专利代理事务所(普通合伙)11489专利代理师曲晶晶(51)Int.Cl.C12P17/06(2006.01)C12R1/19(2006.01)权利要求书1页说明书11页序列表5页附图4页(54)发明名称东莨菪内酯的酶法制备方法(57)摘要本发明涉及一种东莨菪内酯的酶法制备方法，具体包括先制备含有F6’H1基因和阿魏酰辅酶A合成酶基因的重组基因工程菌；再将重组基因工程菌活化、发酵后，以阿魏酸为底物再发酵培养转化得东莨菪内酯。经基因序列优化后，本发明首次将阿魏酰辅酶A合成酶和F6’H1酶同时构建在大肠杆菌中且实现二者同时高效的功能性共表达。建立了以价格低廉、安全低毒可持续的阿魏酸为底物，通过“两个酶‑两步催化‑一锅合成”的方式快速高效便捷合成具有高附加值的产物东莨菪内酯。本发明以1mM阿魏酸为底物催化12h后，生产摩尔产率达到86.5％，获得以阿魏酸为底物生产东莨菪内酯最高产量166.28mg/L，催化过程简单、环保，具有广阔的工业化应用前景。CN115927500ACN115927500A权利要求书1/1页1.东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A.制备含有F6’H1基因和阿魏酰辅酶A合成酶基因的重组基因工程菌；B.将重组基因工程菌活化、发酵后，以阿魏酸为底物再发酵培养转化得东莨菪内酯。2.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，所述F6’H1基因的序列如SEQIDNO.1所示,所述阿魏酰辅酶A合成酶基因的序列如SEQIDNO.3所示。3.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，步骤A中制备重组基因工程菌的表达菌株为大肠杆菌菌株BL21(DE3)。4.根据权利要求1‑3任一项所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，步骤A重组基因工程菌的具体制备方法为：1)将人工合成F6’H1基因构建至质粒pUC57，得到含有目的基因的质粒pUC57‑F6’H1；设计包含BamHI酶切位点的上游引物F6‘H1‑BamHI‑F和包含EcoRI酶切位点的下游引物F6‘H1‑EcoRI‑R，以pUC57‑F6‘H1为模板，PCR扩增含有双酶切位点的F6‘H1基因：ggatcc+F6‘H1+gaattc；同样分别经BamHI和EcoRI双酶切载体pGEX‑6p‑1；将上述目的片段和载体用T4连接酶进行连接；连接完毕后，转化到宿主细胞感受态中；挑选含有F6’H1基因的阳性克隆；2)将人工合成阿魏酰辅酶A合成酶基因构建至质粒pUC57，得到含有目的基因的质粒pUC57‑FCS；设计包含EcoRI酶切位点和核糖体结合位点rbs的上游引物FCS‑EcoRI‑rbs‑F和包含XhoI酶切位点的下游引物FCS‑XhoI‑R，以pUC57‑FCS为模板，PCR扩增含有双酶切位点和核糖体结合位点的FCS基因片段：ggatcc+aaggagatatacca+FCS+ctcgag；同样分别经BamHI和EcoRI双酶切载体pGEX‑F6‘H1；将上述目的片段和载体用T4连接酶进行连接；连接完毕后，转化到宿主细胞感受态中；最后得到含有F6’H1基因和阿魏酰辅酶A合成酶基因的重组基因工程菌。5.根据权利要求4所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，所述上游引物F6‘H1‑BamHI‑F的序列如SEQIDNO.5所示；所述下游引物F6‘H1‑EcoRI‑R的序列如SEQIDNO.6所示。6.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，所述上游引物FCS‑EcoRI‑rbs‑F的序列如SEQIDNO.9所示；所述下游引物FCS‑XhoI‑R的序列如SEQIDNO.10所示。7.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，步骤B中发酵具体为：将活化后的重组基因工程菌以1:20‑70的比例接种于LB培养基中，37℃，250rpm恒温培养直至OD600达到0.6‑0.8，加入IPTG至终浓度为0.8‑1.2mM，37℃，250rpm恒温继续培养4‑12h。8.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，转化后还包括取发酵液加入同等体积的乙酸乙酯进行萃取得到东莨菪内酯。9.一种用于制备东莨菪内酯的F6‘H1基因，其特征在于，所述F6’H1基因的序列如SEQIDNO.1所示。10.一种用于制备东莨菪内酯的阿魏酰辅