抑制NAAA活性的药物筛选模型及其构建方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927198A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202211396348.8C12M1/34(2006.01)(22)申请日2022.11.09C12M1/36(2006.01)C12M1/00(2006.01)(71)申请人自然资源部第三海洋研究所C12M3/00(2006.01)地址361005福建省厦门市思明区大学路184号(72)发明人杨隆河蔡兵贾薇余思宇何西文(74)专利代理机构北京精金石知识产权代理有限公司11470专利代理师王洋(51)Int.Cl.C12N5/10(2006.01)C12N15/867(2006.01)C12N15/65(2006.01)C12Q1/02(2006.01)权利要求书2页说明书11页序列表（电子公布）附图3页(54)发明名称抑制NAAA活性的药物筛选模型及其构建方法(57)摘要本发明涉及一种抑制NAAA活性的药物筛选模型及其构建方法，包括，所述药物筛选模型为包含带有报告基因标签的NAAA慢病毒转染的HEK293T细胞，所述报告基为抗生物抗性基因，携带报告基因的质粒为pLV‑EF1‑purocs2.0‑C‑Flag，其中，插入片段位置为3345bp‑4451bp，所述插入片段包括SEQIDNO:1，本发明还涉及一种抑制NAAA活性的药物筛选模型构建方法，包括，构建重组质粒、培养HEK293T细胞、对HEK293T细胞进行转染，将转染后的HEK293T细胞加入NAAA底物‑buffer溶液建立NAAA抑制剂筛选模型。CN115927198ACN115927198A权利要求书1/2页1.一种抑制NAAA活性的药物筛选模型，其特征在于，所述药物筛选模型为包含带有报告基因标签的NAAA慢病毒转染的HEK293T细胞。2.根据权利要求1所述的抑制NAAA活性的药物筛选模型，其特征在于，所述报告基为抗生素抗性基因。3.根据权利要求2所述的抑制NAAA活性的药物筛选模型，其特征在于，所述携带报告基因的质粒为pLV‑EF1‑purocs2.0‑C‑Flag，其中，插入片段位置为3345bp‑4451bp。4.根据权利要求3所述的抑制NAAA活性的药物筛选模型，其特征在于，所述插入片段包括SEQIDNO:1。5.根据权利要求2所述的抑制NAAA活性的药物筛选模型，其特征在于，所述插入片段包括上游载体SEQIDNO:2和下游载体SEQIDNO:3，其中，插入片段与质粒的摩尔比为2：1‑4：1。6.一种抑制NAAA活性的药物筛选模型构建方法，所述药物筛选模型采用权利要求1‑5所述的抑制NAAA活性的药物筛选模型，其特征在于，步骤S1，构建LV239‑pLV‑EF1‑purocs2.0‑C‑Flag‑hNAAA重组质粒；步骤S2，培养HEK293T细胞，在培养HEK293T细胞中，中控单元根据加入胰酶消化液后预设时间细胞质量对中止过程用于对培养器进行摇晃的摇晃机构的摇晃频率，用于向培养器注入液体的吹打机构的吹打力度和吹打角度进行调节，以使细胞质量符合标准，其中，所述摇晃机构设置于支撑板上，摇晃机构包括用于抓取培养瓶的机械手以及用于控制机械手转动频率的第一动力机构，所述吹打机构设置于所述支撑板上，吹打机构包括深入培养器内的可替换注入器、用于控制经注入器内液体吹打力度的第二动力机构以及控制培养器活动角度进而实现吹打角度调节的支撑机构；步骤S3，对培养后的HEK293T细胞密度进行检测，若细胞密度不符合标准，中控单元判定对细胞质量的标准参数以及吹打机构的吹打力度进行二次调节，以使下一HEK293T细胞的培养符合标准；步骤S3，将配置好的DNA溶液与转染试剂混合形成的混合液注入HEK293T细胞中进行转染，对转染后的HEK293T细胞上清液进行抽滤形成抽滤液，对抽滤液进行浓缩和层析纯化，检测滴度；步骤S4，向转染后的HEK293T细胞加入NAAA底物‑buffer溶液，根据水解产物荧光值，确定建立NAAA抑制剂筛选模型。7.根据权利要求6所述的抑制NAAA活性的药物筛选模型构建方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述中控单元根据加入胰酶消化液后预设时间后，各细胞圆度d确定细胞状态s，设定s＝(d1+d2+……dn)/n，其中，d1为第一细胞圆度，d2为第二细胞圆度……dn为第n细胞圆度，n为视野中细胞总数，中控单元根据获取的细胞状态与预设细胞状态S相比较，选取细胞评价参数，其中，当s≤S1，所述中控单元选取第一预设评价参数A1为细胞评价参数；当S1＜s＜S2，所述中控单元选取第二预设评价参数A2为细胞评价参数；当s≥S2，所述中控单元选取第三预设评价参数A3为细胞评价参数；其中，所述中控单元预设细胞状态S，设定第一预设细胞状态S