表达蛋白的分离与纯化;EMSA.docx

表达蛋白的分离与纯化大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得高表达水平的蛋白，表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%。一、可溶性产物的纯化（融合6×His·Tag的表达蛋白）（一）试剂准备1．Ni-IDA/Ni-NTAResin2．5MNaCl溶液292.2gNaCl（MW58.44）溶解至ddH2O,定容至1L。3．5MImidazole溶液340.4gImidazole（MW68.08）溶解至ddH2O,定容至1L,4℃保存。4．1MTris-HCl溶液（pH8.0）121.14gTrisbase（MW121.14）溶解至ddH2O,使用浓盐酸调节pH至8.0，定容至1L。5．Lysisbuffer/BindingbufferTris-HCl（pH8.0）25mMNaCl150mM6．WashbufferTris-HCl（pH8.0）25mMNaCl150mMImidazole20mM7．ElutionbufferTris-HCl（pH8.0）25mMNaCl150mMImidazole250mM8．RegenerationbufferNaCl500mMImidazole500mM（二）操作步骤1.将500mL含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用40mLLysisbuffer重悬。2.重悬液于冰上超声处理，直至样品澄清，4℃离心14000g×30min，取上清。3.将Ni-IDA/Ni-NTAResin充分悬起，装入纯化柱中。4.使用5mLBindingbuffer平衡纯化柱。5.将蛋白溶液过纯化柱2次。6.使用15mLWashbuffer过柱，充分洗去未结合蛋白。7.用5mLElutionbuffer过柱，每次1mL，洗脱液收集于离心管，置于冰上，取样直接SDS-PAGE分析，蛋白样品进行生化分析，剩余样品保存至-80℃。8.使用5mLRegenerationbuffer过柱，充分洗去纯化柱上残余蛋白。9.大量水冲洗纯化柱后加入15mL20%乙醇保存纯化柱至4℃。二、包涵体的纯化包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%～95%，此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。（一）试剂配制1．缓冲液A：50mMTris-HCl（pH8.0）,2mMEDTA,100mMNaCl2．缓冲液B：50mMTris-HCl（pH8.0）,1mMEDTA,100mMNaCl,1%NP-403．缓冲液Ⅰ：50mMTris-HCl（pH8.0）,2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100(V/V),4M脲素。4．缓冲液Ⅱ：50mMTris-HCl（pH8.0）,2mMEDTA,100mMNaCl,3%TritonX-100。5．缓冲液Ⅲ：50mMTris-HCl（pH8.0）,2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,2M盐酸胍。6．缓冲液C：8M脲素，10mMβ-巯基乙醇，100mMTris-HCl（pH8.0），2mMEDTA。（二）操作步骤1．用缓冲液A漂洗菌体细胞（10ml/g）,离心6000g×15min，收集菌体细胞，重复此步骤，将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。2．将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中，超声破碎，镜检，破碎率高于95%，离心1500g×30min，收集包涵体沉淀。3．将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓