调控珠子参皂苷生物合成PjFPSβ-AS关键酶基因的克隆与功能研究.doc

调控珠子参皂苷生物合成PjFPS/β-AS关键酶基因的克隆与功能研究珠子参为五加科人参属植物,在我国有悠久的药用历史,以其根茎入药。珠子参药材主要分布于云贵、四川、陕西等地,具有抗炎、祛瘀止痛、抗肿瘤、止血、抗氧化等功效。珠子参皂苷是珠子参的主要活性成分,由达玛烷型和齐墩果烷型三萜皂苷组成。目前,珠子参药材多为野生品,其生长周期长,一般生长6-7年方能入药,供需矛盾突出。有必要利用现代分子生物学及基因工程技术研究珠子参皂苷的生物合成途径,进而开展珠子参皂苷的合成生物学研究。本研究首先利用异硫氰酸胍法提取了珠子参愈伤组织的总RNA,并将其反转录形成了cDNA,并以此cDNA为模板,通过同源克隆的方法成功获得PjFPS基因的全长序列（KP684141）,对该序列进行生物信息学分析,构建了pGEM-T-PjFPS克隆载体和植物过表达载体pCMBIA1300s-PjFPS。通过根癌农杆菌转化法将PjFPS转化到野生型珠子参细胞中,获得阳性转基因细胞;依据同样的方法又将PjFPS转化到过表达β-AS基因的珠子参细胞中,并成功获得阳性转基因细胞。通过实时荧光定量PCR、比色法及皂化法等技术测定了转FPS基因阳性细胞系中PjFPS基因的相对表达量、FPS酶活、皂苷和植物甾醇含量变化;并依据同样的技术测定了转FPS/β-AS基因珠子参阳性细胞系中PjFPS以及Pjβ-AS基因的相对表达量、FPS酶活、皂苷和植物甾醇含量变化。生物信息学结果表明:PjFPS基因序列包含一个1029bp的开放阅读框,编码342个氨基酸,分子式为C₁₈₀₈H₂₈₀₉N₄₅₅O₅₂₂S₁₂,分子量39.657kD并具有FPS五个典型的保守结构域。同源序列比对以及系统进化树的结果显示,珠子参关键酶FPS与其它植物的FPS（人参、三七等）起源相同,属于FPS家族中的一员。亚细胞定位预测PjFPS关键酶基因编码的蛋白位于真核生物的细胞质。与野生型珠子参细胞相比,转FPS基因珠子参细胞系中,PjFPS基因的相对表达量、FPS酶活以及皂苷含量均有不同程度提高。而且,由于皂苷合成代谢流的增加,促进了相关重要关键酶基因的表达。在效果最好的阳性细胞中,PjFPS基因的相对表达量、FPS酶活、皂苷含量分别为对照的12倍、4倍、3倍;同时,转基因细胞系的植物甾醇含量也有所升高;与野生型珠子参细胞相比,转FPS/β-AS双基因珠子参细胞系中,PjFPS以及Pjβ-AS基因的相对表达量、FPS酶活、皂苷以及植物甾醇的含量均具有不同程度的提高。在效果最好的转FPS/β-AS基因珠子参阳性细胞中,与未转基因珠子参细胞系相比,植物甾醇和皂苷含量平均被提高了2和3.5倍,而与转FPS基因珠子参细胞系相比平均提高了1倍和0.5倍。Pjβ-AS基因的相对表达量与PjFPS基因的相对表达量与未转基因的珠子参细胞系相比均具有不同程度的提高。本研究表明,对珠子参皂苷合成途径中关键酶基因的表达进行调控可影响皂苷的生物合成,同时双关键酶基因调控比单基因调控效果更好。本研究为获得高效、稳定的珠子参皂苷合成调控技术提供理论参考和依据,同时也为建立皂苷高效的同源或异源表达系统提供科学依据和理论基础。