小麦西农538几丁质酶基因的克隆、表达及功能分析.doc

小麦西农538几丁质酶基因的克隆、表达及功能分析几丁质酶是植物重要的防卫因子之一,与植物的抗病性密切相关。为了进一步扩充几丁质酶基因资源,深入了解其在小麦体内的表达特性及其功能,本研究利用通用引物ChiF/ChiR从不同的小麦材料中,克隆得到几丁质酶基因并对序列进行分析,与表达载体连接在大肠杆菌中进行表达,并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析这些基因在西农538小麦根、茎和叶等不同组织中的表达情况。最后,选取在西农538小麦的根、茎和叶组织中表达量较高的2个几丁质酶基因进一步研究其与条锈病菌的抗性反应试验。结果表明：1.从10份具有不同抗病性的小麦材料中,均能够克隆得到5条长度约960bp的几丁质酶基因序列,依次命名为Cht1、Cht2、Cht3、Cht4和Cht5。利用NCBI在线BLAST软件对这5条基因序列进行同源性比对,结果搜索到100条具有同源性的核苷酸序列,其中Cht5与来自于中国春的Chi-3基因(序列号KJ507387)完全一致,进而将剩余基因提交至GenBank,获得登录号为KR049247～KR049250。2.对新扩增到的Cht1～Cht4基因序列进行分析表明,这些基因均具有完整的开放阅读框,不含内含子,起始密码子均为ATG,终止密码子都是TAG。Chtl～Cht4的核苷酸和氨基酸序列之间的相似性分别为96.84%和91.02%。这四条基因编码的几丁质酶均属于亲水性蛋白,按照不同的分类方法,这些几丁质酶分别属于ClassⅠb类型,同时也属于糖苷水解酶第19家族,是胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。将获得的4条氨基酸序列与NCBI中已知来源的不同类型的几丁质酶蛋白序列进行比对,并构建系统进化树,聚类结果显示,本研究中得到的几丁质酶属于ClassⅠ型。3.SDS-PAGE分析表明,这四条基因对应的重组质粒均能够在表达菌株TranBL21(DE3)中以包涵体的形式表达一个33kDa左右的特异蛋白,与目标蛋白大小一致。4.qRT-PCR分析表明,这5个几丁质酶基因均能够在西农538的根、茎和叶中组成型表达,但在不同组织中具有较大的表达差异：叶中表达量最高,根次之,茎中的表达量最低；同时,这5种几丁质酶基因在同一组织中的表达量也具有明显规律性：Cht4>Cht2>Cht3>Cht1>Chi-3。说明本研究扩增到的几丁质酶基因可能参与了小麦的正常生长发育过程。5.选取相对表达量较高的Cht4基因和Cht2基因进一步验证其对真菌性病害的抗性反应,结果表明,这两个基因的表达均可以受到条锈病菌的诱导,并且Cht4基因表达量与Cht2基因相比更早的出现峰值。Cht4基因在高抗材料92R137中的表达量显著高于中抗材料西农538和感病材料铭贤169,并且均高于同等条件下接ddH20的表达量；Cht2基因在中抗材料西农538中的表达量显著高于高抗材料92R137和感病材料铭贤169,并且抗病材料中的基因表达量高于对照中表达量,但在感病材料铭贤169中该基因表达与对照差别不大。说明Cht4基因和Cht2基因可能参与了小麦叶部抗条锈菌的防御反应。