几丁质酶高产芽孢杆菌的筛选及基因克隆与表达.doc

几丁质酶高产芽孢杆菌的筛选及基因克隆与表达本研究从武汉土壤中筛选出了六株产几丁质酶的芽孢杆菌。通过16SrRNA基因分子鉴定,确定其中4株(D1,D2,D3和D4)为Paenibacillusillinoisensis,另外2株(CDY-607和W1)为解木聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillusxylanilyticus),以解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607为出发菌株获得研究结果如下:解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607几丁质酶发酵液最适反应温度为55℃,最适反应pH值为6.5和8.0,金属离子Fe2+对几丁质酶酶活力有促进作用。对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607产几丁质酶发酵培养基配方及培养条件进行优化,结果表明CDY-607产几丁质酶最佳发酵时间为96h,最佳接种量为5%,最佳装瓶量为100mL,最佳培养基pH值为6.5。产几丁质酶最适发酵培养基配方为胶体几丁质5g/L,硫酸亚铁2g/L,蛋白胨2g/L,酵母膏5g/L。在最适条件下测定的发酵液酶活力(49.26mU/mL)是未优化发酵培养基发酵液酶活力(24.62mU/mL)的2倍。在PCR扩增获得解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607几丁质酶基因部分保守片段后,通过Tail-PCR成功扩增出几丁质酶基因两侧DNA片段。拼接后发现几丁质酶基因长996bp。该基因只含有一个第18糖苷酶家族催化结构域。编码该结构域的序列大小为912bp,共304个氨基酸,预测编码的蛋白质分子量大小为33.42kDa。将该基因与载体pFLAG-CTS重组后于大肠杆菌DH5a中分泌表达,经IPTG诱导培养12h后,采用DNS法测定培养液几丁质酶酶活力为17mU/mL。此外,SDS-PAGE亦成功检测到分泌表达的几丁质酶,大小在33.4kDa左右,与预测结果相符。