丙泊酚对小鼠成肌细胞自噬的影响及其机制的研究.doc

丙泊酚对小鼠成肌细胞自噬的影响及其机制的研究近年的研究表明,丙泊酚不仅在动物的脓毒症休克中有保护作用,在器官和细胞的缺血/再灌注（I/R）、氧化应激损伤中同样有保护作用。丙泊酚对心肌细胞和海马细胞的保护作用就表现为保护心肌细胞和海马细胞对抗I/R的自噬性细胞死亡。包括丙泊酚、七氟烷在内的全麻药都会上调骨骼肌的自噬行为,这种自噬现象在全麻过程中呈时间依赖性逐渐上调,并在六小时时达到高峰,且去神经支配与全麻状态缺一不可。但是,关于丙泊酚发挥对自噬的促进作用是通过何种更具体的分子机制,以及是否能够对实际的临床用药有指导意义的相关研究很少。自噬是胞质溶胶和细胞器被隔离到双层膜的小泡中后运送到溶酶体/空泡中降解,并使形成的大分子进行再循环的一个过程。自噬过程发生时,细胞会消化掉自身的一部分,即self-eating,这个过程初一看似乎是不利于细胞的。但事实上,如果没有诱发因素存在,正常情况下细胞只维持较低程度的自噬以维持自稳。而所谓的诱发因素,既有来自于细胞外的诸如外界中的营养成分不足、缺血、缺氧、生长因子的浓度的变化等,也有来自于细胞内的,比如细胞内的代谢压力、衰老或破损的细胞器堆积、蛋白质折叠错误或异常聚集等。但是在细胞存活和生长的过程中,这些因素是经常存在的,因此,正常情况下,细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳,同时,自噬在机体的细胞成分更新,组织代谢,生长和发育等一系列重要的生命基本进程中发挥着非常重要的生物学作用。在疾病形成的过程中自噬同样扮演着非常重要的角色,包括神经退行性疾病,Danon肌病等许多疾病的发生、发展都与自噬关系密切。自噬本身是一种保护性的生理过程,确保细胞稳态以及细胞内功能协调,然而自噬过度激活则会造成严重的细胞结构和功能的破坏,因此我们不能简单地定义自噬对于生物体的利弊。有研究表明,内质网应激和自噬相互影响的关系对于骨骼肌疾病中肌纤维损伤的发生发展非常重要。内质网应激依赖性的肌细胞死亡和肌炎以及dysferlin相关的营养不良肌病的肌细胞损伤有关。内质网应激是由于蛋白合成过度增加,错误折叠蛋白增多,细胞内钙含量不平衡,糖、能量缺乏,局部缺血等潜在的病理生理干扰素增加,内质网稳态遭到破坏失衡,进而产生的一种细胞对于外界不良因素的保护性应答机制。目前的研究主要集中在胰腺和脂肪组织中,而在骨骼肌中研究并不多。内质网适应性的应答机制有:第一unfoldedproteinresponse（UPR）。UPR激活可以上调3ERmembrance-associatedprotein、PERK、IRE1以及ATF6蛋白表达,使之合成增加,同时伴侣蛋白的基因和蛋白表达也会增加,例如BIP/Grp78以及Grp94,在内质网应激发生的过程中表达会上调。内质网应激激活之后释放内质网腔内的钙离子到细胞质中,激活钙依赖性细胞通路。细胞内钙离子增加,钙离子激活CaMKKβ,激活MAPK通路激活自噬。同时,细胞内钙离子增加,增加的钙离子会激活PKCs磷酸化,进而诱导LC3转移对TG、TN刺激的内质网应激产生应答。也就是说,细胞内钙离子增加与内质网应激在激活自噬的过程中有协同作用。此外,内质网将大量钙离子释放到细胞质内,会引起线粒体肿胀,破坏呼吸链功能,也会增强自噬的进程。第二,ERoverloadresponse（EOR）。EOR可以通过上调NF-κb通路相关蛋白的表达,以及调节炎症应答来发挥其保护作用。如果EOR和UPR都没有被激活,则细胞在不良的外界环境中将进入程序性细胞死亡的阶段。丙泊酚在不同的组织器官中以及肿瘤细胞中发挥的保护作用,这种保护作用也与MAPK通路,NF-κB等有密切联系。丙泊酚可能是通过调节细胞内钙离子流量调节线粒体功能和脑内代谢以发挥其保护作用。包括丙泊酚在内的全麻药在大鼠的麻醉中会促进骨骼肌自噬。基于以上的事实,丙泊酚对骨骼肌细胞自噬的促进作用,是否是通过内质网应激来发挥作用值得探讨,需要深入研究。本文以小鼠成肌细胞（C2C12）为研究对象,探讨了丙泊酚对真核生物正常细胞自噬的作用及其机制,为丙泊酚的作用机制提供新的研究思路。方法:（1）分别用不同浓度的丙泊酚（0μM、25μM、50μM、100μM、150μM、250μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM）处理小鼠成肌细胞（C2C12）48h。CCK8法检测不同浓度丙泊酚对分化的小鼠成肌细胞（C2C12）生存率的影响。分别用不同浓度的丙泊酚（400μM、900μM）处理分化的小鼠成肌细胞（C2C12）3h,通过流式细胞仪用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞内ROS的变化。（2）为了检测丙泊酚对自噬的作用,分别用不同浓度的丙泊酚（50μM、100μM、200μM、400μM）处理分化的小鼠成肌细胞（C2C12