丙泊酚对脓毒症小鼠脾脏树突状细胞亚群及TNF-α、IL-10水平的影响.doc

丙泊酚对脓毒症小鼠脾脏树突状细胞亚群及TNF-α、IL-10水平的影响目的本研究采用盲肠结扎法(CLP)建立脓毒症小鼠模型,对比观察内毒素组和丙泊酚治疗组小鼠各时相点树突状细胞的数目、成熟度以及亚型,此外还同时检测各时相点TNF-α和IL-10的水平,以综合评估各时相点炎症状态。本实验从丙泊酚能诱导脓毒症小鼠树突细胞向调节性树突细胞分化角度阐释丙泊酚对脓毒症免疫平衡的影响,以期为麻醉镇静药物在ICU的合理应用提供依据。方法将60只BalB/c小鼠随机均分为三组即假手术组(Sham组)、丙泊酚注射组(P组)和生理盐水注射组(NS组),其中P组和NS组按盲肠结扎穿孔法制备脓毒症小鼠模型,而假手术组仅开腹翻动盲肠。造模成功后,生理盐水组和丙泊酚组分别给予等量的0.9%生理盐水和丙泊酚(按照15mg/kg计算注射量)腹腔注射,Sham组不作任何处理,所有实验动物在造模成功后的0h、6h、12h、24h和36h处死,每个时间节点处死4只小鼠;在设定好的每个时间节点将实验小鼠眼球取血待后续检测细胞因子,然后用脊髓脱颈法处死小鼠后留取脾脏,去除被膜后剪碎并研磨;收集细胞悬液加入到小鼠淋巴细胞分离液上,离心后留取中层絮状物,缓冲液再次重悬,离心后去除多余的淋巴细胞分离液;使用DCs阴选试剂盒分选获得DCs,通过添加抗CD11c、CD45RB磁珠选出CD11clowCD45RBhighDCs,将纯化的CD11clowCD45RBhighDCs孵育24h,离心留取孵育液上清保存待检测细胞因子;将获得的DCs用PBS重悬后加入CD11c-APC、CD45RB-PE抗体标染,CD40-FITC、CD80-FITC、CD86-FITC、I-a/e-FITC,避光孵育15min采用流式细胞仪检测DC亚群分化及细胞表面相关标记物;严格按照酶联免疫吸附试剂盒说明书测定实验中涉及的细胞因子TNF-α及IL-10的浓度。结果1流式细胞仪检测结果显示小鼠脾脏树突状细胞分成了CD11chighCD45RBlowDCs(传统性树突状细胞)、CD11clowCD45RBhighDCs(调节性树突状细胞)和CD11clowCD45RBlowDCs三个亚群;2经过同型对照流式细胞仪对调节性树突状细胞CD11clowCD45RBhighDCs表面分子检测后发现CD40、CD80、CD86和MHC-II类分子等均处于低度表达或者弱表达状态,符合CD11clowCD45RBhighDCs的不成熟特性;3与生NS组比较,0~6h时P组R1(传统性树突状细胞CD11chighCD45RBlowDCs)和R2(调节性树突状细胞CD11clowCD45RBhighDCs)所占比例变化并没有显著变化,从12h开始,两组中R1所占比例变化不明显,而P组的R2比例比NS组明显升高(P<0.05),在24h~36h,P组的R2比例仍旧比NS组显著增加(P<0.05);4脓毒症模型组小鼠血清中IL-10和TNF-α水平均较Sham组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);而在经过丙泊酚的刺激后,该组血清中TNF-α水平较NS组明显下降同时IL-10水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);5经Pearson直线相关性分析表明,P组CD11clowCD45RBhighDCs比例增加与孵育液中IL-10水平呈现显著的正相关(r=0.355,P<0.05)。结论1脓毒症早期无论是促炎因子TNF-α还是抗炎因子IL-10均有一定程度的升高,说明此时机体免疫处于失衡状态。2脓毒症早期丙泊酚的应用可以促使脾脏树突状细胞向调节性树突状细胞分化,并在一定程度上抑制细胞因子TNF-α的分泌同时增加IL-10的分泌。3丙泊酚组调节性树突细胞比例增加与IL-10分泌量呈现一定的正相关性,因此我们推测丙泊酚在脓毒症早期发挥作用可能是通过促使树突状细胞向调节性树突状细胞分化并增加负向免疫功能的细胞因子分泌水平来实现的。