一种利用简并引物扩增进行全基因组分子标记开发的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115961007A(43)申请公布日2023.04.14(21)申请号202211418813.3(22)申请日2022.11.14(71)申请人中国农业科学院农业基因组研究所地址518120广东省深圳市大鹏新区鹏飞路7号B5栋(72)发明人赵胜常玉晓王重荣(74)专利代理机构北京三友知识产权代理有限公司11127专利代理师韩蕾张德斌(51)Int.Cl.C12Q1/6869(2018.01)C12Q1/6806(2018.01)C40B50/06(2006.01)权利要求书1页说明书10页序列表（电子公布）附图5页(54)发明名称一种利用简并引物扩增进行全基因组分子标记开发的方法(57)摘要本发明提供了一种利用简并引物扩增进行全基因组分子标记开发的方法。本发明首先提供一种全基因组分子标记检测方法，其包括：采用随机简并引物，对待测样本的基因组DNA进行热不对称交错式PCR扩增；对PCR扩增产物进行纯化并构建测序文库。本发明利用单条随机简并引物进行热不对称交错式PCR扩增，增强引物与DNA模板间的错配结合，利用非特异性扩增进行全基因组基因型检测。CN115961007ACN115961007A权利要求书1/1页1.一种全基因组分子标记检测方法，该方法包括：采用随机简并引物，对待测样本的基因组DNA进行热不对称交错式PCR扩增；对PCR扩增产物进行纯化并构建测序文库。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述随机简并引物的长度为8‑25nt，优选为8‑15nt；更优选地，所述随机简并引物包含3‑7个简并碱基。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述随机简并引物的简并度为64‑4096，优选为120‑3072。4.根据权利要求1‑3任一项所述的方法，其中，所述随机简并引物的5’端额外添加4‑10nt的barcode序列。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述热不对称交错式PCR扩增包括在较高退火温度和较低退火温度下交错进行循环反应的过程；优选地，所述热不对称交错式PCR扩增包括在较高退火温度下与较低退火温度下交错进行6‑15轮循环，每轮循环包括2‑3个循环单元且其中至少1个在较高退火温度下退火的循环单元以及至少1个在较低退火温度下退火的循环单元；优选地，较高退火温度为50‑60℃，较低退火温度比较高退火温度低5‑15℃。6.根据权利要求1或5所述的方法，其中，所述热不对称交错式PCR扩增包括至少两阶段循环反应：第一阶段循环反应包括在较高退火温度下进行3‑7轮循环，每轮循环包括变性、较高退火温度下退火、延伸；第二阶段循环反应包括在较高退火温度下与较低退火温度下交错进行6‑10轮循环，每轮循环包括变性、较高退火温度下退火、延伸、变性、较高退火温度下退火、延伸、变性、较低退火温度下退火、延伸；其中，较高退火温度为50‑60℃，较低退火温度比较高退火温度低5‑15℃。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述热不对称交错式PCR扩增按照以下条件进行：90‑98℃预变性1min‑5min；90‑98℃变性20s‑2min，较高退火温度下退火30s‑1min，72℃延伸1min‑3min；3‑7轮循环；90‑98℃变性20s‑2min，较高退火温度下退火30s‑1min，72℃延伸1min‑3min；90‑98℃变性20s‑2min，较高退火温度下退火30s‑1min，72℃延伸1min‑3min；90‑98℃变性20s‑2min，较低退火温度下退火30s‑1min，72℃延伸1min‑3min；6‑10轮循环；72℃终延伸5min‑10min；其中，各较高退火温度各自独立地为50‑60℃，较低退火温度为40‑50℃。8.根据权利要求1所述的方法，其中，PCR扩增产物纯化后，进行3’末端加A、连接Y型Illumina测序接头，完成测序文库的制备。9.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括：对测序文库进行测序，或者，测序文库经片段分选后用于高通量测序；进一步地，该方法还包括对测序数据进行分析及基因型鉴定。10.权利要求1‑9任一项所述的方法在基因组育种中进行全基因组基因型检测的应用。2CN115961007A说明书1/10页一种利用简并引物扩增进行全基因组分子标记开发的方法技术领域[0001]本发明是关于一种利用简并引物进行全基因组分子标记检测方法及相关应用，属于基因工程技术领域。背景技术[0002]基因组学和功能基因组学的快速发展以及表型组学技术的不断进步，推动着作物育种技术的更新迭代。在这个过程中，基于分子标记的全基因组基因型检测是核心环节。从上个世纪八十年代开始至今，DNA分子标记技术主要经历了三代的快速发展历程：第一代是以限制性酶切和Southern分子杂交为基础，主要包