Pup基因敲除的结核分枝杆菌H37Ra菌株的构建方法及应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115976091A(43)申请公布日2023.04.18(21)申请号202211563847.1C12N15/90(2006.01)(22)申请日2022.12.07C12N1/21(2006.01)A61K39/04(2006.01)(71)申请人石河子大学A61P31/06(2006.01)地址832000新疆维吾尔自治区石河子市C12R1/32(2006.01)北四路221号(72)发明人张万江冯楠柳小玲吴芳吴江东张杰董江涛王菊张辉徐芳赵正涌梁粟朱荟云(74)专利代理机构北京东方盛凡知识产权代理有限公司11562专利代理师牛娟妮(51)Int.Cl.C12N15/74(2006.01)C12N15/31(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表（电子公布）附图1页(54)发明名称Pup基因敲除的结核分枝杆菌H37Ra菌株的构建方法及应用(57)摘要本发明公开了Pup基因敲除的结核分枝杆菌H37Ra菌株的制备方法及应用，属于基因工程领域。上述制备方法包括以下步骤：(1)扩增Pup基因上下游同源臂，并将上下游同源臂构建到Cosmid质粒上，构建重组质粒；(2)将所述重组质粒转导λ噬菌体，构建重组噬菌体；(3)将所述重组噬菌体转染H37Ra菌株，制备Pup基因敲除的结核分枝杆菌H37Ra菌株。进一步通过小鼠体内实验研究，结果发现：本发明制备的Pup基因敲除的结核分枝杆菌H37Ra菌株可以显著降低结核分枝杆菌的感染，并且在小鼠体内表现出长效性和稳定性，可以作为结核病疫苗的潜在菌株。这为结核病发病机制的研究和抗结核药物的研发提供了理论基础。CN115976091ACN115976091A权利要求书1/1页1.一种Pup基因敲除的结核分枝杆菌H37Ra菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)扩增Pup基因上下游同源臂，并将上下游同源臂构建到Cosmid质粒上，构建重组质粒；(2)将所述重组质粒转导噬菌体，构建重组噬菌体；(3)将所述重组噬菌体转染结核分枝杆菌，制备Pup基因缺失重组菌株。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Pup基因上下游同源臂之间包含氨苄青霉素抗性基因序列。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述结核分枝杆菌为H37Ra。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，扩增Pup基因上游同源臂的引物为：Pup‑N‑F：5’‑GAACACCCGCTGTAGACCTATC‑3’；Pup‑N‑R：5’‑GACATTCATCCCAGGTGGCAACGATACGACCCGCGCTCTGCGGG‑3’；扩增Pup基因下游同源臂的引物为：Pup‑C‑F：5’‑TCTGGGGTTCGAAATGACCGAACTGCGGCTGCTCGACGGTTTCCG‑3’；Pup‑C‑R：5’‑CACGCCCGCTGTCTTTCT‑3’。5.一种Pup基因敲除的结核分枝杆菌H37Ra菌株，其特征在于，是由权利要求1‑4任一项所述的制备方法获取。6.如权利要求5所述的Pup基因敲除的结核分枝杆菌H37Ra菌株在制备抗结核分枝杆菌药物或者疫苗中的应用。7.一种抗结核分枝杆菌的药物，其特征在于，包括权利要求5所述的Pup基因敲除的结核分枝杆菌H37Ra菌株。8.一种结核病疫苗，其特征在于，包括权利要求5所述的Pup基因敲除的结核分枝杆菌H37Ra菌株。2CN115976091A说明书1/5页Pup基因敲除的结核分枝杆菌H37Ra菌株的构建方法及应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种Pup基因敲除的结核分枝杆菌H37Ra菌株的构建方法及应用。背景技术[0002]结核病是由结核分枝杆菌(MycobacteriumTuberculosis)引起的世界性传染病，也是一种单一致病菌感染导致死亡率最高的疾病，全世界约有1/3的人感染结核分枝杆菌，严重影响人类的健康。因此，结核病的预防、早期诊断以及及时治疗都是高度关注的课题，在世界范围内也是重点防控的疾病之一。[0003]结核分枝杆菌是国际标准减毒株H37Ra菌株，是目前科研方面广泛使用的菌株，尤其是广泛应用于与结核病相关的生物医药研究中。目前临床上分离多种结核分枝杆菌，并且随着药物的使用，耐药性出现，使得世界范围内的结核病的防治形式愈加严峻。而防治结核病的关键就是对结核分枝杆菌的耐药机理和致病机理进行研究，而关于这方面的研究目前主要是通过失活或者缺失特定的基因，分析结核分枝杆菌突变株与结核病进程的关系，进而了解其基因和疾病间的关系。[0004]目前，用于结核病防治的有效手段就是卡介苗接种，但是疫苗在预防保护的同时，都会或多或少的干扰疫苗免疫和自然感染的诊断和鉴别，而且有的疫苗株也会对人有不同程