一种通过苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒用家蚕生产嵌合蚕丝的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115992181A(43)申请公布日2023.04.21(21)申请号202210482505.0(22)申请日2022.05.05(71)申请人苏州大学地址215137江苏省苏州市相城区济学路8号(72)发明人贡成良胡小龙王崇龙朱敏郭仕程邱群婻童新宇(74)专利代理机构苏州创元专利商标事务所有限公司32103专利代理师孙周强陶海锋(51)Int.Cl.C12N15/866(2006.01)C07K19/00(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表3页附图3页(54)发明名称一种通过苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒用家蚕生产嵌合蚕丝的方法(57)摘要本发明公开了通过苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒用家蚕生产嵌合蚕丝的方法，构建含FibL‑MaSp‑c‑polyAFibL片段的质粒pFAST‑FibL‑MaSp‑c，转化含有AcBacmidDH10Ac大肠杆菌筛选获得重组AcBacmid‑FibL‑MaSp‑c，转染Sf‑9细胞获得重组病毒AcNPV‑FibL‑MaSp‑c，接种5龄家蚕幼虫，用浸渍或喷洒过抗生素药液的凉干后的新鲜桑叶饲养1天，后用新鲜桑叶饲养至见熟蚕，用浸渍或喷洒过蜕皮激素药液的新鲜桑叶饲喂见熟蚕；或直接用蜕皮激素药液体喷见熟蚕，将熟蚕移至簇具，营茧后采茧，蚕茧烘干后，经过缫丝获嵌合蚕丝，满足制备各种生物材料对丝蛋白的多样性的需求。CN115992181ACN115992181A权利要求书1/1页1.一种通过苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒用家蚕生产嵌合蚕丝的方法，其特征在于，包括下列步骤：（1）将FibL‑MaSp‑c‑polyAFibL片段克隆进pFAST‑Bac‑Dual的多克隆位点构建质粒pFAST‑FibL‑MaSp‑c；所述FibL‑MaSp‑c‑polyAFibL片段的序列为SEQIDNO:1；（2）将质粒pFAST‑FibL‑MaSp‑c转化含有AcBacmidDH10Ac大肠杆菌，后涂布于LB琼脂培养基平板上培养，再挑取白色菌落，提取重组AcBacmid‑FibL‑MaSp‑cDNA；（3）将重组AcBacmid‑FibL‑MaSp‑cDNA转染草地夜蛾培养细胞，然后培养至细胞发病，然后取细胞培养上清再次接种培养细胞，然后培养至细胞发病，再收集细胞培养上清，离心纯化得到重组苜蓿银纹夜蛾杆状病毒粒子AcNPV‑FibL‑MaSp‑c；（4）将步骤（3）收集的细胞培养上清或者重组苜蓿银纹夜蛾杆状病毒粒子AcNPV‑FibL‑MaSp‑c接种家蚕幼虫，然后饲养至上蔟；然后营茧、采茧、缫丝，得到嵌合蚕丝。2.根据权利要求1所述通过苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒用家蚕生产嵌合蚕丝的方法，其特征在于，LB琼脂培养基含有四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG和X‑gal。3.根据权利要求1所述通过苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒用家蚕生产嵌合蚕丝的方法，其特征在于，步骤（2）中，培养的温度为37℃。4.根据权利要求1所述通过苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒用家蚕生产嵌合蚕丝的方法，其特征在于，步骤（3）中，培养细胞为Sf9培养细胞，培养的温度为26～27℃。5.根据权利要求1所述通过苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒用家蚕生产嵌合蚕丝的方法，其特征在于，家蚕幼虫为5龄家蚕幼虫。6.根据权利要求1所述通过苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒用家蚕生产嵌合蚕丝的方法，其特征在于，饲养至见熟蚕，然后用蜕皮激素处理，再上蔟。7.根据权利要求6所述通过苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒用家蚕生产嵌合蚕丝的方法，其特征在于，家蚕幼虫饲养至见熟蚕过程中，采用抗生素处理一次。8.根据权利要求1所述通过苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒用家蚕生产嵌合蚕丝的方法，其特征在于，25℃环境下营茧，7天后采茧。9.根据权利要求1所述通过苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒用家蚕生产嵌合蚕丝的方法生产的嵌合蚕丝。10.苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒与FibL‑MaSp‑c‑polyAFibL片段在家蚕生产嵌合蚕丝中的应用。2CN115992181A说明书1/8页一种通过苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒用家蚕生产嵌合蚕丝的方法技术领域[0001]本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种通过苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒用家蚕生产含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝的嵌合蚕丝的方法。背景技术[0002]蜘蛛丝机械性能优异、免疫原性小，在纺织、生物医用材料和国防工业领域具有广阔的应用前景。与一般的吐丝昆虫不同，蜘蛛有多个产丝腺体，能分别产生主壶腹腺丝、次壶腹腺丝、鞭毛状丝、胶性腺丝、葡萄状腺丝、管状腺丝和聚合状腺黏液蛋白。不同的蛛丝或蛛丝蛋白具有不同的生物学功能，其性能也有明显的差异。蛛丝蛋白具有3个功能区域，氨基酸序列的两端分别形成N端结构域和C端结构域，由不重复的氨基酸序