基于EAT1基因构建水稻显性核不育材料的方法及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115992148A(43)申请公布日2023.04.21(21)申请号202211384240.7A01H5/00(2018.01)(22)申请日2022.11.07A01H6/46(2018.01)C12Q1/6895(2018.01)(71)申请人四川农业大学C12N15/11(2006.01)地址611130四川省成都市温江区惠民路211号(72)发明人李双成邹挺陶阳陈豪李平邓其明王世全梁越洋朱军刘怀年(74)专利代理机构成都海成知识产权代理事务所(普通合伙)51357专利代理师庞启成(51)Int.Cl.C12N15/29(2006.01)C07K14/415(2006.01)C12N15/84(2006.01)权利要求书1页说明书11页序列表（电子公布）附图5页(54)发明名称基于EAT1基因构建水稻显性核不育材料的方法及其应用(57)摘要本发明提供一种基于EAT1基因构建的水稻显性核不育表达载体及其应用。所述表达载体有Ubiquitin启动子和水稻雄花发育基因EAT1可操作的连接而形成。具体构建方法包括：获取水稻cDNA，并以其为模板，采用EAT1基因的特异引物扩增EAT1基因，得到PCR产物片段；将PCR产物片段连入带有Ubiquitin启动子的骨架载体中即得。利用该表达载体获得的转基因植株表现为显性核雄性不育，并可通过杂交创制水稻显性核雄性不育系。利用该显性核不育系进行轮回选择育种，可快速淘汰非目标材料，高效聚合多种优异性状和基因，且不含有转基因成分，有效提高育种效率和安全性。CN115992148ACN115992148A权利要求书1/1页1.一种基于EAT1基因构建的水稻显性核不育表达载体，其特征在于：所述表达载体由Ubiquitin启动子和水稻雄花发育基因EAT1可操作的连接而形成。2.权利要求1所述的表达载体的构建方法，其特征在于：包括：获取水稻cDNA，并以其为模板，采用EAT1基因的特异引物扩增EAT1基因，得到PCR产物片段；将PCR产物片段连入带有Ubiquitin启动子的骨架载体中，即得。3.根据权利要求2所述的表达载体的构建方法，其特征在于：所述特异引物包括上游引物EAT1‑OE‑F和下游引物EAT1‑OE‑R，序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。4.权利要求1所述的表达载体或者权利要求2或3所述的构建方法获得的表达载体在调控水稻植株育性上的应用。5.一种水稻显性核雄性不育植株的构建方法，其特征在于：是采用权利要求1所述的表达载体或者权利要求2或3所述的构建方法获得的表达载体，构建方法包括：步骤1，将所述表达载体转化到农杆菌中并培养；步骤2，将获得的含有表达载体的农杆菌浸染水稻愈伤组织，然后进行脱分化和再分化处理；步骤3，炼苗并移栽培养，即得。6.一种水稻显性核雄性不育系的构建方法，其特征在于：是以权利要求5所述的构建方法获得的水稻显性核雄性不育植株为母本，以可育水稻作为父本，通过杂交方法获得。7.权利要求6所述的构建方法获得的水稻显性核雄性不育系的鉴定方法，其特征在于：是将获得的水稻显性核雄性不育系种子叶片提取RNA并反转录为cDNA，以该cDNA为模板，利用EAT1基因的鉴定引物对EAT1基因进行qPCR反应，再与野生型中EAT1的表达进行比较，其中EAT1的表达量显著高于野生型的即为水稻显性核雄性不育系，所述显著高于的标准为：P<0.05，T检验。8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于：所述叶片取自水稻显性核雄性不育系种子从苗期到成熟期生长阶段的任一时期。9.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于：所述鉴定引物包括上游引物EAT1‑RT‑F1和下游引物EAT1‑RT‑R1，序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；并且所述鉴定方法以OsActin1基因为内参基因，内参引物包括上游引物Actin1‑RT‑F1和下游引物Actin1‑RT‑R1，序列分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。10.利用权利要求6所述的构建方法获得的水稻显性核雄性不育植株进行轮回选择育种的方法，包括：（1）以上述水稻显性核雄性不育植株为母本，具有优良性状和基因的水稻为父本，进行杂交，收获F1种子；（2）将F1种子种植并人工隔离，抽穗期分离出不育株和可育株；以不育株作为母本，授以可育株的花粉，收获不育株上的种子，作为第1轮轮回选择群体种子；（3）将第1轮轮回选择群体种子进行种植并人工隔离，抽穗期分离出不育株和可育株；同样以不育株作为母本，授以可育株的花粉，收获不育株上的种子，作为第2轮轮回选择群体种子；（4）根据育种需求重复步骤（3）若干次，即可得到若干轮轮回选择群体。2CN115992148A说明书