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(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115991764A(43)申请公布日2023.04.21(21)申请号202310276337.4(22)申请日2023.03.21(71)申请人杭州因智拓生物技术有限公司地址310000浙江省杭州市富阳区银湖街道龙溪北路399号第9幢第1层101室(72)发明人叶升刘斯刁蔚蔚朱培马明雪(74)专利代理机构杭州果智唯实知识产权代理事务所(普通合伙)33518专利代理师沈钱(51)Int.Cl.C07K14/78(2006.01)C12N15/70(2006.01)权利要求书2页说明书10页附图3页(54)发明名称羟脯氨酸修饰的重组III型人源化胶原蛋白及其制备方法和应用(57)摘要本发明涉及一种羟脯氨酸修饰的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段,为如下蛋白片段中的任一种:蛋白片段a:其包含n个串联的如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的重复单体,n≥1;其中至少1个重复单体中的至少1个脯氨酸被羟脯氨酸替代;蛋白片段b:与蛋白片段a具有83‑97%同一性且保留蛋白片段a的细胞黏附性能;蛋白片段c:对蛋白片段a的氨基酸序列进行修饰后得到的保留蛋白片段a的细胞黏附性能。本发明的人源化胶原蛋白片段同源性高,其严格遵守Gly‑X‑Y的重复序列,细胞黏附性和生物活性高,具有高的脯氨酸羟化率,结构稳定,在护肤品、皮肤修复敷料、植入剂、人工皮肤、医疗器械或保健食品中具有广泛应用前景。CN115991764ACN115991764A权利要求书1/2页1.一种羟脯氨酸修饰的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段,其特征在于,所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段为如下蛋白片段中的任一种:蛋白片段a:其包含n个串联的如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的重复单体,n为整数且n≥1;其中,至少1个重复单体中的至少1个脯氨酸被羟脯氨酸替代;蛋白片段b:与所述蛋白片段a具有83‑97%同一性且保留所述蛋白片段a的细胞黏附性能的蛋白片段;蛋白片段c:对所述蛋白片段a的氨基酸序列进行修饰后得到的保留所述蛋白片段a的细胞黏附性能的蛋白片段;所述修饰包括对蛋白片段的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基;添加、插入和缺失不发生在重复单体中或重复单体之间;取代是指所述蛋白片段a的氨基酸序列上的部分氨基酸发生保守性替换。2.根据权利要求1所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段,其特征在于,所述蛋白片段a中,n=1~15,当n≥2时,各重复单体之间直接串联。3.根据权利要求1所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段,其特征在于,所述蛋白片段a还包含至少一段如SEQIDNO.2所示氨基酸序列;其与SEQIDNO.1所示氨基酸序列的C端直接相连。4.根据权利要求3所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段,其特征在于,所述蛋白片段a具有一段如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。5.一种核酸分子,所述核酸分子包含编码权利要求1‑4任一项所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段的核苷酸序列或其互补序列。6.根据权利要求5所述的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子具有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列。7.一种携带编码权利要求1‑4任一项所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段的多核苷酸或其互补序列的重组质粒、重组载体或重组细菌。8.一种制备重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段的方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)将编码重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段的基因与编码脯氨酸‑4‑羟化酶的基因共转入宿主细胞,将宿主细胞在培养基中培养使其产生蛋白;其中,编码Ⅲ型人源化胶原蛋白片段的基因是通过对SEQIDNO.3所示的氨基酸序列反向设计并根据宿主细胞进行密码子优化得到;编码脯氨酸‑4‑羟化酶的基因是通过对SEQIDNO.6所示的氨基酸序列反向设计并根据宿主细胞进行密码子优化得到;(2)收取并纯化所述蛋白;(3)酶切所述蛋白;(4)纯化酶切后的蛋白,获得目的蛋白片段。9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤(1)的方法为:将SEQIDNO.5所示的核苷酸序列通过KpnI和BamHI的酶切位点插入pET‑32a表达载体,得到重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段的表达载体;将SEQIDNo.7所示的核苷酸序列通过NcoI和XhoI的酶切位点插入pET‑28a表达载体,得到脯氨酸‑4‑羟化酶L593的表达载体;将构建成功的两种表达载体pET‑32a和pET‑28a共转入大肠杆菌感受态细胞BL21。2CN115991764A权利要求书2/2页10.权利要求1‑4任一项所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段在制备护肤品、皮肤修复敷料、植入剂、人工皮肤、医疗器械或保健食品中的应用。3CN115991764A说明书1/10页羟脯氨酸修饰的重组III型人源化胶原蛋白及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领