羟脯氨酸修饰的重组III型人源化胶原蛋白及其制备方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115991764A(43)申请公布日2023.04.21(21)申请号202310276337.4(22)申请日2023.03.21(71)申请人杭州因智拓生物技术有限公司地址310000浙江省杭州市富阳区银湖街道龙溪北路399号第9幢第1层101室(72)发明人叶升刘斯刁蔚蔚朱培马明雪(74)专利代理机构杭州果智唯实知识产权代理事务所(普通合伙)33518专利代理师沈钱(51)Int.Cl.C07K14/78(2006.01)C12N15/70(2006.01)权利要求书2页说明书10页附图3页(54)发明名称羟脯氨酸修饰的重组III型人源化胶原蛋白及其制备方法和应用(57)摘要本发明涉及一种羟脯氨酸修饰的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段，为如下蛋白片段中的任一种：蛋白片段a：其包含n个串联的如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的重复单体，n≥1；其中至少1个重复单体中的至少1个脯氨酸被羟脯氨酸替代；蛋白片段b：与蛋白片段a具有83‑97%同一性且保留蛋白片段a的细胞黏附性能；蛋白片段c：对蛋白片段a的氨基酸序列进行修饰后得到的保留蛋白片段a的细胞黏附性能。本发明的人源化胶原蛋白片段同源性高，其严格遵守Gly‑X‑Y的重复序列，细胞黏附性和生物活性高，具有高的脯氨酸羟化率，结构稳定，在护肤品、皮肤修复敷料、植入剂、人工皮肤、医疗器械或保健食品中具有广泛应用前景。CN115991764ACN115991764A权利要求书1/2页1.一种羟脯氨酸修饰的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段，其特征在于，所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段为如下蛋白片段中的任一种：蛋白片段a：其包含n个串联的如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的重复单体，n为整数且n≥1；其中，至少1个重复单体中的至少1个脯氨酸被羟脯氨酸替代；蛋白片段b：与所述蛋白片段a具有83‑97%同一性且保留所述蛋白片段a的细胞黏附性能的蛋白片段；蛋白片段c：对所述蛋白片段a的氨基酸序列进行修饰后得到的保留所述蛋白片段a的细胞黏附性能的蛋白片段；所述修饰包括对蛋白片段的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基；添加、插入和缺失不发生在重复单体中或重复单体之间；取代是指所述蛋白片段a的氨基酸序列上的部分氨基酸发生保守性替换。2.根据权利要求1所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段，其特征在于，所述蛋白片段a中，n=1~15，当n≥2时，各重复单体之间直接串联。3.根据权利要求1所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段，其特征在于，所述蛋白片段a还包含至少一段如SEQIDNO.2所示氨基酸序列；其与SEQIDNO.1所示氨基酸序列的C端直接相连。4.根据权利要求3所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段，其特征在于，所述蛋白片段a具有一段如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。5.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码权利要求1‑4任一项所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段的核苷酸序列或其互补序列。6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子具有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列。7.一种携带编码权利要求1‑4任一项所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段的多核苷酸或其互补序列的重组质粒、重组载体或重组细菌。8.一种制备重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将编码重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段的基因与编码脯氨酸‑4‑羟化酶的基因共转入宿主细胞，将宿主细胞在培养基中培养使其产生蛋白；其中，编码Ⅲ型人源化胶原蛋白片段的基因是通过对SEQIDNO.3所示的氨基酸序列反向设计并根据宿主细胞进行密码子优化得到；编码脯氨酸‑4‑羟化酶的基因是通过对SEQIDNO.6所示的氨基酸序列反向设计并根据宿主细胞进行密码子优化得到；（2）收取并纯化所述蛋白；（3）酶切所述蛋白；（4）纯化酶切后的蛋白，获得目的蛋白片段。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（1）的方法为：将SEQIDNO.5所示的核苷酸序列通过KpnI和BamHI的酶切位点插入pET‑32a表达载体，得到重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段的表达载体；将SEQIDNo.7所示的核苷酸序列通过NcoI和XhoI的酶切位点插入pET‑28a表达载体，得到脯氨酸‑4‑羟化酶L593的表达载体；将构建成功的两种表达载体pET‑32a和pET‑28a共转入大肠杆菌感受态细胞BL21。2CN115991764A权利要求书2/2页10.权利要求1‑4任一项所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白片段在制备护肤品、皮肤修复敷料、植入剂、人工皮肤、医疗器械或保健食品中的应用。3CN115991764A说明书1/10页羟脯氨酸修饰的重组III型人源化胶原蛋白及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领