一种产磷脂酶D的SBT5工程菌及其构建方法与应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116004491A(43)申请公布日2023.04.25(21)申请号202210949410.5C12Q1/60(2006.01)(22)申请日2022.08.09C12R1/465(2006.01)(71)申请人安徽大千生物工程有限公司地址231200安徽省合肥市经开区桃花工业园繁华大道工投·立恒工业广场B12C(72)发明人芮双印朱鹏翔(74)专利代理机构合肥兴东知识产权代理有限公司34148专利代理师王伟(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12N15/55(2006.01)C12N15/76(2006.01)C12Q1/44(2006.01)权利要求书2页说明书8页序列表（电子公布）(54)发明名称一种产磷脂酶D的SBT5工程菌及其构建方法与应用(57)摘要本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种产磷脂酶D的SBT5工程菌。本发明还提供了上述产磷脂酶D的SBT5工程菌的构建方法，方法如下：磷脂酶D基因的定点突变、突变体的筛选、磷脂酶D基因突变体的糖基化位点分析、糖基化位点定点优化及全基因合成、初步工程菌的获得、pMS82‑PLDAnti质粒的抽提、重组链霉菌菌株的构建。同时，本发明还提供了上述产磷脂酶D的SBT5工程菌在sdLDL‑C检测试剂盒开发中的应用。本发明的优点在于：本发明构建的工程菌能够高效表达PLD蛋白，水解酶活达130.5U/mL，实现了对现有sdLDL‑C检测试剂盒中PLD的替代，最大程度地降低生产成本。CN116004491ACN116004491A权利要求书1/2页1.一种产磷脂酶D的SBT5工程菌，其特征在于，所述工程菌包括如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。2.一种产磷脂酶D的SBT5工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)磷脂酶D基因的定点突变选择S.chromofuscus色褐链霉菌来源的磷脂酶D作为野生型磷脂酶D的目的基因，基因序列如SEQIDNO.1所示；对所述目的基因进行定点突变，将目的基因中的连续两个丙氨酸Ala利用人工诱导突变为两个甘氨酸Gly，以获得适合在变铅青链霉菌SBT5中高效表达的基因序列，突变后的基因序列如SEQIDNO.2所示；(2)突变体的筛选剔除掉突变不完全、诱变不彻底的基因，选择突变完全、序列清晰的目的基因进行下一步操作；(3)磷脂酶D基因突变体的糖基化位点分析将定点突变后的磷脂酶D基因利用相关软件分析蛋白的糖基化位点；(4)糖基化位点定点优化及全基因合成为了消除潜在的被糖基化修饰位点影响，将潜在的糖基化位点的脯氨酸Pro优化为精氨酸Arg，并将糖基化位点改造后的序列进行全基因合成；最终改造后的基因序列如SEQIDNO.3所示；(5)初步工程菌的获得将步骤(4)完成的序列连接在pMS82载体上，且基因上下游分别插入NotI和EcoRI酶切位点，接着转化入SBT5菌获得初步工程菌；(6)pMS82‑PLDAnti质粒的抽提对步骤(5)得到的初步工程菌进行质粒提取，并采用琼脂糖凝胶电泳检测提取质粒的质量，检测合格的pMS82‑PLDAnti质粒继续用于后续实验；(7)重组链霉菌菌株的构建将检测合格的pMS82‑PLDAnti质粒转入变铅青链霉菌SBT5，即得目标所需的产磷脂酶D的SBT5工程菌。3.根据权利要求2所述的产磷脂酶D的SBT5工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，采用定量PCR或荧光免疫原位杂交检测目的基因的突变情况，剔除掉突变不完全、诱变不彻底的基因，选择突变完全、序列清晰的目的基因进行下一步操作。4.根据权利要求2所述的产磷脂酶D的SBT5工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，利用NetNGlyc1.0Server在线软件分析蛋白的糖基化位点。5.一种如权利要求1所述的产磷脂酶D的SBT5工程菌在sdLDL‑C检测试剂盒开发中的应用，其特征在于，利用所述产磷脂酶D的SBT5工程菌所产生的磷脂酶D作为催化剂生产sdLDL‑C检测试剂盒。6.根据权利要求5所述的产磷脂酶D的SBT5工程菌在sdLDL‑C检测试剂盒开发中的应用，其特征在于，利用所述SBT5工程菌获得磷脂酶D的方法为：(1)重组PLD蛋白的摇瓶发酵①将SBT5工程菌菌株，接种至5mLBMGY试管中，27℃，250～280rpm过夜培养；2CN116004491A权利要求书2/2页②将过夜培养的菌液按2％的接种量转接至含有50mLISP2培养基的摇瓶中，27℃，250～280rpm培养至OD600＝2～6；③用无菌的离心管，1500～3000×g离心收集细胞。诱导表达时，去除上清，用牛肉膏蛋白胨培养基重悬细胞至OD600＝1.0进行诱导表达；④每24小时，加甲醇至最适终浓度诱导蛋