一种产D-塔格糖的毕赤酵母工程菌及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115873735A(43)申请公布日2023.03.31(21)申请号202211034583.0C12P19/02(2006.01)(22)申请日2022.08.26C12R1/84(2006.01)(71)申请人江苏大学地址212013江苏省镇江市京口区学府路301号(72)发明人齐向辉王江飞张国艳员君华路成玉尤瓦赵梅翟彼得(74)专利代理机构南京智造力知识产权代理有限公司32382专利代理师石晓花(51)Int.Cl.C12N1/19(2006.01)C12N15/61(2006.01)C12N15/81(2006.01)C12N15/64(2006.01)权利要求书2页说明书7页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称一种产D-塔格糖的毕赤酵母工程菌及其构建方法和应用(57)摘要本发明提供了一种产D‑塔格糖的毕赤酵母工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域；在本发明中，利用基因工程手段，在巴斯德毕赤酵母的基础上构建了表达L‑阿拉伯糖异构酶的基因工程菌，并将该基因工程菌用于转化D‑半乳糖制备D‑塔格糖；所述基因工程菌克服了原核表达系统翻译过程中L‑阿拉伯糖异构酶可能形成包涵体问题的缺陷，在制备D‑塔格糖中具有很好的应用。CN115873735ACN115873735A权利要求书1/2页1.一种产D‑塔格糖的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述工程菌是在巴斯德毕赤酵母中表达L‑阿拉伯糖异构酶，所述L‑阿拉伯糖异构酶为胞内组成型表达。2.根据权利要求1所述的产D‑塔格糖的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述编码L‑阿拉伯糖异构酶的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。3.权利要求1或2所述的产D‑塔格糖的毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下：(1)重组载体pGAPZB‑araA的构建：以植物乳杆菌全基因组为模板，采用araA‑F/araA‑R引物对进行PCR扩增，得到带有pGAPZB同源臂的araA片段；用EcoRⅠ和KpnⅠ酶对质粒pGAPZB进行线性化处理得到线性化质粒pGAPZB；然后将所述带有pGAPZB同源臂的araA片段和得到的线性化质粒pGAPZB进行连接，得到重组载体pGAPZB‑araA；(2)产D‑塔格糖的毕赤酵母工程菌的构建：使用AP‑F/GAP‑R引物对将重组载体pGAPZB‑araA反向PCR扩增进行线性化处理，然后转化至巴斯德毕赤酵母感受态细胞中，筛选后得到产D‑塔格糖的毕赤酵母工程菌。4.根据权利要求3所述的产D‑塔格糖的毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，araA‑F/araA‑R引物对中，araA‑F的核苷酸序列如SEQIDNo:2所示；araA‑R的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示；PCR扩增条件为：预变性：98℃、3min，变性：98℃、10s，退火：46℃、30s，延伸：72℃、25s，终延伸：72℃、10min，33个循环。5.根据权利要求3所述的产D‑塔格糖的毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，AP‑F/GAP‑R引物对中，GAP‑F的核苷酸序列如SEQIDNo:4所示；GAP‑R的核苷酸序列如SEQIDNo:5所示；反向PCR扩增条件为：预变性：98℃、30s，变性：98℃、10s，退火：53℃、30s，延伸：72℃、25s，终延伸：72℃、10min，33个循环。6.根据权利要求3所述的产D‑塔格糖的毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述巴斯德毕赤酵母为毕赤酵母GS115。7.权利要求1所述的产D‑塔格糖的毕赤酵母工程菌在制备D‑塔格糖中的应用。8.一种全细胞转化制备D‑塔格糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)静息细胞的制备：将上述产D‑塔格糖的毕赤酵母工程菌接种至YPD培养基中培养，然后离心收集菌体，洗涤，然后用含Triton‑x‑100的磷酸缓冲液处理，离心得产D‑塔格糖的毕赤酵母工程菌的静息细胞；(2)D‑塔格糖的制备：将产D‑塔格糖的毕赤酵母工程菌的静息细胞加入D‑半乳糖缓冲液中，加入Mn2+反应转化生成D‑塔格糖。9.根据权利要求8所述的全细胞转化制备D‑塔格糖的方法，其特征在于，步骤(1)中，培养条件为：在30℃、220rpm条件下培养48h；所述含Triton‑x‑100的磷酸缓冲液为含有1％Triton‑x‑100(v/v)的50mM磷酸缓冲液，2CN115873735A权利要求书2/2页所述磷酸缓冲液的pH值为7.0；所述处理时间为30min。10.根据权利要求8所述的全细胞转化制备D‑塔格糖的方法，其特征在于，步骤(2)中，反应的条件为在pH值为6.8～8.0、220rpm的条件下，60℃反应20h；所述静息细胞的添加量为60g