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氧化铝柱层析精制三七总皂苷工艺研究论文氧化铝柱层析精制三七总皂苷工艺研究论文【摘要】目的研究氧化铝柱层析精制三七总皂苷工艺。方法采用HPLC法测定三七总皂苷的含量,考察洗脱剂的浓度、洗脱剂的用量和吸附剂用量对工艺的影响。结果确定最佳精制工艺为:洗脱剂的浓度为55%乙醇,洗脱剂的用量为10倍吸附剂的用量,吸附剂用量为5倍三七总皂苷的`用量。结论通过氧化铝柱层析精制后,三七总皂苷的收率大于70%,含量大于80%,说明此精制工艺是可行的。【关键词】三七总皂苷氧化铝高效液相法三七为五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根茎[1],三七总皂苷是中药三七的有效部位,主要含有三七皂苷R1,人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1等达玛烷型三萜皂苷类化合物[2]。现代药理研究证明:三七总皂苷具有多方面的生物活性,主要表现在扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、改善心肌代谢、抗自由基、抗凝、钙拮抗等方面[3]。目前三七总皂苷的富集与纯化一般采用大孔吸附树脂来完成[4],纯化后三七总皂苷的含量达到60%以上。为了提高药物的安全性和有效性,提高其成药原料药的纯度。本实验拟采用氧化铝柱层析对三七总皂苷的纯化物进行精制[5],并对工艺进行了考察,为进一步的制剂学研究打下基础。1仪器与试药1.1仪器与设备RE52-99旋转蒸器(上海亚荣生化仪器厂);DK-S22型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);JA-1003型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限医疗设备厂);美国Tsp高效液相色谱仪;TspP-2000泵、TspUV-1000UV-VIS检测器;TspPC1000色谱工作站;色谱柱:ODSC18柱(250×4.6mm,5μm,大连依利特科学仪器有限公司)。1.2材料与试剂三七总皂苷提取物(云南玉溪天然药物有限公司);三七总皂苷对照品:三七皂苷R1(0745-200008)、人参皂苷Rg1(0703-200015)、人参皂苷Rb1(0704-200115)对照品(中国药品生物制品检定所);乙腈为色谱纯,水为二次蒸馏水。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱:ODSC18柱(250×4.6mm,5μm);流动相:A为乙腈,B为水;流速:1.0mL·min-1;采用梯度洗脱法,0~8分钟(26:74),8:10~40:40分钟(34:66);检测波长203nm;柱温:30℃;进样量20μL。2.2线性范围关系的考察分别精密称取三七总皂苷对照品三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1各约6.0mg、2.5mg和2.5mg置25mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密吸取此溶液3、4、5、6、7mL置50mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀。精密吸取上述对照品溶液各注入液相色谱仪,记录色谱图,量取峰面积,以峰面积(A)对进样量(μg)进行线性回归,三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1回归方程分别为:A=327127.8W-681.2(r=0.9991);A=406964.1W+787.9(r=0.9991);A=262563.9W-5498.7(r=0.9996),三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂Rb1分别在进样量0.2981~0.6956μg、1.2768~2.9792μg和1.1539~2.6925μg范围内时,峰面积与进样量具有良好的线性关系。2.3精密度试验取含量测定项下对照品溶液,连续进样六次,记录色谱图,量取峰面积,计算平均值及相对标准偏差,三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的峰面积平均值分别为151792、802039.7和476940.7,RSD分别为0.81%、1.73%和1.62%,结果表明,本方法精密度良好。2.4供试品溶液的制备取上柱流出液浓缩至干,精密称定干粉一定量,用甲醇溶解并转溶至10mL量瓶,滤过。精密量取续滤液1mL置10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。2.5工艺参数的考察2.5.1洗脱剂浓度的考察取三七总皂苷原料3份,每份10g。分别用50%乙醇适量溶解,分别转移至氧化铝柱(中性氧化铝50g,内径4cm,干法装柱),然后分别用35%、55%和75%乙醇洗脱,分别收集洗脱液,减压回收乙醇,真空干燥,按HPLC法测定总皂苷含量和收率。从以上结果可知,当用75%乙醇洗脱时,总皂苷含量最高,但收率太低,而用55%乙醇洗脱时虽然收率比用35%乙醇洗脱时略低,但总皂苷含量高6%左右,因此,洗脱剂确定为55%乙醇。2.5.2洗脱剂用量考察取三七总皂苷原料3份,每份10g。分别用50%乙醇适量溶解,分别转移至氧化铝柱(中性氧化铝50g,内径4cm,干法装柱),然后用55%乙醇洗脱,分别收集洗脱液,减压回收乙醇,真空干燥,按HPL