淀粉酶活性测定方法的改进-李雯.docx

淀粉酶活性测定方法的改进-李雯淀粉酶活性测定方法的改进-李雯植物生理学通讯第４１卷第５期，２００５年１０月655淀粉酶活性测定方法的改进李雯１，２邵远志１陈维信２，＊１海南大学生命科学与农学院，海口５７０２２８；２华南农业大学园艺学院第一文库网，广州５１０６４２ImprovedMethodforDeterminingAmylaseActivityLIWen1,2,SHAOYuan-Zhi1,CHENWei-Xin2,*1CollegeofLifeScienceandAgriculture,HainanUniversity,Haikou570228,China;2CollegeofHorticulture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China提要以香蕉果实为试材，对常规的淀粉酶活性的测定方法进行了改进，取得了更好的效果。关键词淀粉酶活性；测定方法；改进淀粉酶是反映淀粉分解速度、研究糖代谢规律的一个重要指标之一。香蕉是典型的贮藏淀粉的果实，果实采后其淀粉转化为可溶性糖。了解淀粉酶活性的变化规律对研究香蕉果实采后生理及贮藏保鲜十分重要。测定淀粉酶活性常采用的是酶动力学方法中的化学法［１］。果实淀粉酶活性的测定一般是借鉴文献２￣４的方法，但这些方法在测定香蕉果实淀粉酶活性时，操作繁琐，重复性较差。本文就酶液的提取、反应步骤的取舍等方面对这些方法作了改进，取得了较好的效果。剂为国产分析纯试剂。２．２测定方法２．２．１酶液的提取将每一个重复的３个果实去皮后切碎混匀，称取其果肉１ｇ，置于预冷的研钵中，加２ｍＬ预冷的０．１ｍｏｌ·Ｌ－１柠檬酸溶液（ｐＨ５．６）和少量石英砂研磨，将匀浆移入７ｍＬ的离心管中，再分别用１ｍＬ的０．１ｍｏｌ·Ｌ－１柠檬酸缓冲液（ｐＨ５．６）冲洗２次，于４℃下以１５０００×ｇ离心１５ｍｉｎ，上清液转移入另一个５ｍＬ离心管中，作为酶提取液备用。２．２．２酶活性的测定取洁净的试管１８支，作好标记，每一个样品设１个对照。总反应体积为０．５ｍＬ，测定管含０．２ｍＬ的酶提取液和０．３ｍＬ的１％淀粉溶液；对照管含０．２ｍＬ的酶提取液和０．３ｍＬ的０．１ｍｏｌ·Ｌ－１柠檬酸溶液（ｐＨ５．６，不含底物淀粉）。将试管放入恒温４０℃的水浴锅中，保温３０ｍｉｎ后取出，立即加入１．５ｍＬ的ＤＮＳ试剂终止反应。再将试管置于沸水浴中１０ｍｉｎ，取出后冰浴冷却。取反应液稀释１０倍，测定波长５２０ｎｍ处的吸光值，同上做麦芽糖标准曲线，从标准曲线上查出麦芽糖的含量，计算淀粉酶的总活性。上述的酶的提取和测定，与文献２的常规方法相比较，有以下４个改进：（１）可用缓冲液作为淀粉酶的提取液和底物淀粉的溶液；（２）将原来的材料与方法１材料实验在华南农业大学的广东省果蔬保鲜重点实验室进行。材料为巴西香蕉果实（Ｍｕｓａｓｐｐ．ＡＡＡＧｒｏｕｐ，Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ），购自水果市场。试材选３种成熟度差异非常明显的果实进行测定：（１）绿熟硬果，（２）中等黄熟微软果，（３）黄熟极软果。所选果实大小一致、无病虫害、无机械伤，每类果实９个果，重复３次。２方法２．１试剂配制淀粉酶提取缓冲液：０．１ｍｏｌ·Ｌ－１柠檬酸溶液（ｐＨ５．６）；１％的.淀粉溶液：用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１的柠檬酸缓冲液（ｐＨ５．６）配制；标准麦芽糖溶液（１ｍｇ·ｍＬ－１）；３，５－二硝基水杨酸试剂（ＤＮＳ试剂）：称取６．５ｇ３，５－二硝基水杨酸溶于少量水中，移入１０００ｍＬ容量瓶中，加入３２５ｍＬ２ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＯＨ溶液，再加入４５ｇ丙三醇，摇匀，冷却后定容到１０００ｍＬ。淀粉和麦芽糖为Ｓｉｇｍａ产品，其余试656植物生理学通讯第４１卷第５期，２００５年１０月３次稀释步骤改为只稀释１次；（３）不用ＮａＯＨ溶液终止反应，而用ＤＮＳ试剂显色同时终止反应；（４）耗时从５ｈ减少到３．５ｈ。结果是一致的，说明改进方法可以反映香蕉果实后熟过程中淀粉酶活性的变化情况，具有可操作性；（２）常规方法测得的淀粉酶活性比改进方法测得的低，２种方法测得的３种成熟度果实的酶活性分别相差０．３３８、０．３５１和０．２５１ｍｇ·ｇ－１（ＦＷ）·ｈ－１，表明改进的方法可测得更高的淀粉酶活性；（３）３种成熟度果实中淀粉酶活性的标准误值和变异系数都小于常规方法，说明改进的方法其实验误差比常规方法小。结果与讨论从表１可以看出：（１）绿熟硬果、中等黄熟微软果、黄熟极软果３种不同成熟度的果实淀粉酶活性表现出低、高、低的趋势，各成熟度果实间存在极显著差异（Ｐ＜０．０１），２种测定方法得到的表１香蕉果实中淀粉酶活性测定方法的比较酶活性／ｍｇ·ｇ－１（ＦＷ）·ｈ－１标准误变异系数／％果实类别常规方法改进方法常规方法改进方法常规方法改进方法绿熟硬果中等黄熟微软果黄熟极软果１．５３４Ｂ