时间分辨荧光分析法---副本.ppt

时间分辨荧光分析法及其应用目录一、基本概念：5.时间分辨荧光分析法（Timeresolvedfluoroisnmunoassay,TRFIA）是近十年发展起来的非同位素免疫分析技术，是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏度高达10-19g/ml，较放射免疫分析（RIA）高出3个数量级。它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点时间分辨荧光免疫原理图2.优点三、时间分辨荧光分析技术简介1.2稀有元素双功能螯合剂稀土元素作为金属离子,很难直接与抗原抗体结合,因此在标记时需要有一种双功能基团的螯合物,它们分子内或带氨基和羧基或带有异硫氰酸基和羧酸基,一端与稀土离子连接,一端与抗原或抗体的自由氨基(组氨酸、酪氨酸)连接。1.3增强溶液免疫反应后所形成的复合物,在弱碱性缓冲液中经紫外光激发所产生的荧光信号甚弱,这主要是因为水是稀土离子经紫外光激发所产生荧光的淬灭剂。所以要加入一种增强液。增强液一般由β-二酮体、三辛基氧化磷(TOPO)、TritonX-100、醋酸和邻苯二甲酸氢钾(pH2.0~3.2)组成。2.基本技术：2.3反应模式常用的有双位点夹心法和固相抗体竞争法。2.3.1双位点夹心分析法使用针对被测物上不同抗原决定簇的两个单克隆抗体,一个用Eu3+标记,另一个包被固相载体,经过免疫反应形成免疫复合物后,再将Eu3+从复合物上完全解离下来,在Eu3+的增强液中与另一种螯合剂结合,在协同剂的作用下,形成一个Eu3+包裹于其内部的微胶囊(胶态分子团)。它在激发光作用下能发射出很强的荧光信号,其强弱与待测抗原(或抗体)含量相关。该法用于测定蛋白质类大分子化合物。2.3.2固相抗体竞争法是对一些小分子半抗原化合物,因分子质量小,不能直接进行固相包被,如多肽、甲状腺激素类和一些药物等,都必须经过化学耦联剂与载体蛋白质进行共价键结合,然后可包被聚苯乙烯微量滴定条孔壁,制成固相抗原.四、时间分辨荧光分析法的应用2.在微生物方面的应用由于TRFIA的方法灵敏度高,在1979年它的理论形成后,研究重点放在试剂开发和利用上；1982年研制出用于测定风疹病毒抗体TRFIA的试剂；1986年开创快速诊断流感的TRFIA方法；2002年有关于同时检测弓形体IgM和IgA抗体TRFIA方法.3.分子生物学的应用标记的链霉亲合素2生物素探针,则会使核酸杂交整个过程变得快速、简单。目前,稀土元素标记探针技术已用于检测HIV、检测前列腺特异性抗原(PSA)的mRNA、腺病毒DNA、肺炎链球菌DNA和HLA227等位基因,获得了满意的结果。4.在激素方面的应用用TRFIA检测人血清胰岛素含量;检测了hCG;血清中的甲状腺激素;国外还用它检测动物的激素;TRFIA分析血清、EDTA抗凝血浆和柠檬酸钠抗凝血浆激素含量差别,发现只有在分析促甲状腺激素(TSH)、胰岛素(Ins)、TT3、雌二醇(E2)、Testo(睾酮)和Prog(孕酮)时柠檬酸钠抗凝血浆与血清有差别。现在TRFIA已经取代RIA、EIA等方法,检测项目涉及甲状腺激素、性腺激素、下丘脑分泌的激素、胰岛素、胃泌素等各个方面。五、时间分辨荧光分析法在真菌毒素检测方面的应用2.真菌毒素的测定方法3.实例分析：黄曲霉毒素B1的时间分辨荧光免疫分析AFB1干扰信息RNA和DNA的合成，是在翻译水平上干扰了蛋白质生物合成，影响细胞代谢，因而它与人类及动物的许多疾病存在着联系。AFB1引起人的中毒主要是损害肝脏，发生肝炎,肝区疼痛，黄疸，肝硬化,肝坏死乃至死亡，还可有心脏扩大、痉挛、昏迷、胃肠道大出血等异常表现。长期食用被AFB1污染的食物被认为是导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病的主要原因，也能诱发肾癌、乳腺癌及卵巢癌等。世界卫生组织推荐食品、饲料中AFB1的含量不能超过15μg/kg，在婴儿食品中不能检出;欧盟国家的规定更加的严格，规定了日常生活食用品中的AFB1的含量不得超过2μg/kg，总量不超过4μg/kg，最近已将部分食品中的AFB1的含量限定在0.1μg/kg以内。我国对AFB1的污染和控制也非常重视，在1982年颁布了粮油和发酵食品中的AFB1允许量标准。规定大米、食用油中AFB1的含量不超过10μg/kg，其他粮食、豆类及发酵食品的含量不能超过5μg/kg。材料与仪器AFB1-TRFIA检测方法的建立：反应过程图方法3.固相抗原制备将AFB1-HRP用50mmol/LNa2CO3-NaHCO3pH9.6缓冲液稀释至0.5mg/L的包被液,96孔微孔板各孔加100μL，4℃放置过夜。弃去包被液，冲洗三次，加150μL含2g/L明胶的上述缓冲液封闭